质粒DNA的提取及检测

质粒DNA的提取及检测

质粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。

常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等

质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）

常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500~700Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA

质粒的检测——凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第一部分质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。

二、实验原理

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。三、实验材料、器具及药品

实验器具

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。实验材料含PUCm-T的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高压灭菌

2.溶液溶液Ⅰ200ml50mmol/L葡萄糖1.98g25mmol/LTris-Cl(pH8.0)5ml1M10mmol/LEDTA(pH8.0)5ml0.4M溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(最终pH4.8)3.分离液酚/氯仿/异戊醇＝25:24:14.无水乙醇5.70%乙醇6.无菌水各试剂的作用：

溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA

四、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中

6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存第二部分琼脂糖凝胶电泳

相关知识电泳：泳动速度决定于？

琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度

0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb

5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。常用染料EB:溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。Genefinder:新型低毒，高灵敏度染料，加入样胶中，价格较低。一、实验目的

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。二、实验原理

DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电；PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

三、仪器、材料与试剂

（一）

仪器（二）材料1.自已提取的质粒DNA2.相对分子质量标准品（三）试剂1．5×TBE储液(PH8.0)使用时稀释10倍成0.5×TBE（1×TBE也可）。2．凝胶加样缓冲液