REACH法规 第四卷译稿4

精品文档精心整理精品文档可编辑的精品文档REACH法规第四卷译稿4目录：1、REACH法规第四卷译稿42、REACH法规第四卷译稿9B.1三步法急性毒性(口饲)–急性毒性等级方法1.方法1.1.引言急性毒性分级方法给危险性评估和危险性分类提供信息。基于研究的结果,这种方法使用三份固定的剂量使一个化合物被足够地分开以至能够分类。此外，在这一个测定方法中被描述的实验步骤允许选择使用三个附加的固定剂量。它们可以也被当作假设结论的选项，又可以用作更进一步的选项。在更进一步的改良值得去做或需要去做的情况下，我们将考虑附加药剂的使用。方法使用定义了初始剂量，但这并不意味着计算精确可达到LD50。相反，由于动物样品的死亡是整个实验的终点，当死亡可以预料时，超出一定范围的剂量也是允许的。实验的结果应该允许根据附件Ⅵ标准来分类。依据这种方法持续性，测定的时间可以比B.1中描述的要长。这种方法的主要优点是，它所需的动物数量比急性毒性（口饲）（B.1）和选择性固定剂量方法（B.1两步法）要少。也见一般引言B部分。1.2.定义见一般引言B部份。1.3.测定方法原理对一组实验动物通常使用一种改良了的剂量，使用渐进的实验步骤来测定实验物质的性质。每一步使用同性别的三只动物。没有必要进行实验前的光照研究。关系到动物死亡率的物质缺少或存在的剂量使用取决于上一步的剂量，例如：没有必要进行更深一步的测定下一步，药剂的剂量没有改变，但被用于另一种性别的动物下一步，将使用下一个更高或更低的剂量水平1.4.测定方法的描述1.4.1.随机选取健康年轻的动物，标上记号以示区别，为了让它们熟悉环境，还得在测定前五天把它们关进笼子里。这些动物可以根据性别和剂量水平进行划组归笼，但每个笼子里面动物不能太多以至干扰了对每个个体的清晰观察。测定物质以确定的剂量用胃管或插管强食地注入动物体内。如果需要，测定物质要被溶解或悬浮在合适的媒介物质中。建议只要可能的话，首先考虑用水，再考虑用油或其他媒介物。对于非水溶性测定物，在测定前必须知道或确定媒介物的毒性。动物在使用剂量前应该禁食；但水要保证供给。1.4.2.测定条件1.4.2.1.测定动物除非有禁忌症，一般老鼠是常用的啮齿动物。雌性必须是未生育的和没有怀孕的。在研究的开始阶段，每种性别的体重差别不得超过平均水平的20%。1.4.2.2.数量和性别每一步骤用同性别的三只动物.在开始，性别可以任选。1.4.2.3.剂量水平使用的初始剂量是从三个确定的水平里选择的，如25,200和2000mg/kg.而且初始剂量应该有利于导致部分样品的死亡。在附件Ⅰ里面描述的操作流程也可以依据初始剂量做相应的参考文献。对于性别和初始剂量的选择，应该利用所有可用的信息，包括组织活性相关的信息。当结果显示死亡并不是出现在最大使用剂量时，就应该进行限制的测定。如果不了解被测定物质的情况，出于动物生存着想，建议使用200mg/kg的初始剂量。有时，非常需要得到比确定剂量水平更高的精度，在这种情况下，就需要考虑额外的剂量水平如5，50或500mg/kg等。由于腐蚀性或严重的刺激性反应能引起明显的痛苦的剂量无需实施。处理组之间的时间间隔在毒性迹象的初始，中期和最严重时分别测定。其他性别的动物或下个剂量的处理要延迟直到我们相信前一个剂量下的动物能存活下来。1.4.2.4.极限测定在一个药剂等级中，两组异性动物（每组3只）需要消耗至少2000mg/kg的试剂。若出现与化合物有关的死亡，则需考虑进一步消耗200mg/kg的试剂来测定。1.4.2.5.观察期观察期需延续至少14天，除非动物已死或者需要中止研究并人道宰杀。当然，其长度并非严格规定的，需就实验中毒发反应、开始毒发的比率以及康复期的长度等具体情况作适当调整。毒发开始及结束、出现死亡的时刻十分重要，特别是当中毒反应的出现有延迟的迹象时。每一只动物样品的观察结果需独立地、系统地记录下来。1.4.3.实验步骤在测定动物样品的禁食期过后称重，再使其与测定物质接触，接触过后，3－4小时内动物不得进食进水。如果药剂是连续分批提供给动物样品的，则视接触期的长度以供给动物食物。一次提供给动物样品的液态药剂的最大量由动物样品的体格大小决定。供给啮齿类动物，用量通常不超过1ml/100g；如果是含水的溶液，则2ml/100g也可行。应通过调节药剂浓度来将所需药剂量的变化降至最低，以保证所有药剂浓度等级的量恒定。若不能一次性提供给动物以药剂，则可以分批供给，但供给期不得超过24个小时。测定步骤的细节参看附录1。1.4.3.1.总体观察与药剂接触的当天至少需要对测定动物进行两次详细地临床观察，在动物有反应的当天需要进行更多次的临床观测，之后每天起码一次。垂死的以及呈现出持续经历剧痛的动物需被人道无痛宰杀。人道宰杀的动物也被视为测定致死。当动物死亡或被人道宰杀时，应尽量准确地把时间记录下来。如果有动物持续显示出中毒迹象，则需特别观察。观察应包括以下方面的变化情况：皮肤及毛发、眼睛、黏液膜、呼吸系统、循环系统、自主系统、中枢神经系统、肢体运动神经活动以及行为方式。特别需要对以下几方面关注：呼吸行为、惊恐、抽筋、唾液分泌、下痢腹泻、无知觉无感觉、睡眠和昏迷。每一只动物样品的所有观察结果需独立地、系统地记录下来。1.4.3.2.体重在与测定物质接触前，所有动物均需称重，测定开始后，每周也至少称重一次。需计算和记录其体重变化情况。测定结束后，所有仍生还的动物需先称重再人道宰杀。1.4.3.3.解剖所有被测定的动物（包括在测定过程中死亡或被中止测定的）均需被解剖。每只动物样品的肢体病理学变化均应记录下来。还应考虑对器官进行显微镜检查所得到的肢体病变的信息（当动物存活了24小时或更长时间）。2.实验数据应提供动物样品的独立实验数据。另外，每个测定小组都应以表格形式对实验数据进行总结。表格应表明以下几个方面：测定所使用的测定动物样品的数目、呈现中毒迹象的动物样品的数目、测定过程中死亡或人为处死的动物样品的数目、每只动物样品的死亡时间、中毒迹象出现以及消失的时间以及对此现象的描述以及解剖发现。有关对实验结果进行评价讨论的指导参看附录2。3.实验结果报告实验结果报告测定结果应包含以下几方面信息：测定动物：测定动物种类、来源；测定动物样品的已知的微生物状况；测定动物样品的数量、年龄及性别；动物来源、饲养环境、饮食情况等；每一只动物在以下几个时刻的体重：测定开始时、开始后每周以及测定结束时。测定条件：如不用水，选用其他媒介物的理由；向测定动物提供测定物质的细节，包括药剂的量以及接触时间；供给的水与食物质量的详细情况，包括其来源和种类；选择何种初始剂量的合理理由。实验结果：某一性别、药剂浓度等级的响应实验数据制成表格形式（即测定动物所显示的中毒迹象，包括：死亡率、类型、程度及持续时间）；每只动物从开始呈现中毒迹象到恢复（如果有恢复）所经历的时间过程；每只动物样品的解剖结果以及任何组织病理学上的发现。结果讨论结论4.参考文献此方法与OECDTG423相类似。

附录１检测步骤1.按1.4.2.3.所示，起始剂量应在被测定动物之中造成一定的死亡率。以下是一些用以选择起始剂量的凭据：－物理化学性质数据；－组织-行为关系；－其他毒性测定实验的实验数据；－对测定物质的前期使用情况。2.在此附录中，每一种起始剂量都有其独立的测试步骤，测试程序随后给出。根据人道宰杀的动物样品或测试中死亡动物的数目依图表箭头来选择测定步骤。3.当起始剂量为25或200mg/kg时，另一性别的动物死亡数目为一只时，通常来说，不要进行进一步的测定。然而，如果从另外五只动物身上无法观察到中毒现象，分析时应考虑到死亡数与施以药剂无关；这样，则需提高药剂的浓度等级继续实验。4.当药剂量为2000mg/kg时两个性别各有一只动物死亡，做LC50测定的结果应该会超过这个值。然而，由于这个结果是不定的，所以需要仔细观察参考文献两性各剩余的两只动物样品的反应，这四只动物样品的明显的中毒迹象的出现可以很好地导致符合LC50值（2000mg/kg或更少）的种类的出现，并且为同浓度等级的药剂的进一步的测定提供依据。5.这个过程允许检测以三种附加的固定剂量（选项2）.这种选项要能够在特定的时候转为另一种可选择的操作,或者能够用于在实际测定结束以后的更进一步测定（选项1）。选项1中，测定步骤用粗箭头表示，而在选项2中，测定步骤用细箭头来表示。

附录２有关选项1测定结果的说明在此附录表中，“不要进一步测定”一格下的灰格表示分类的临界值。依照选项1规定的实验步骤，顺着合适的箭头往下直到涉及的“灰格子”。精品文档精心整理精品文档可编辑的精品文档B.6.皮肤敏感度测定1.测定方法1.1.引言注释：在与大众健康相关的毒性分类系统中，找寻潜在的人类皮肤感光剂的实验的灵敏度和能力是很重要的。没有一种方法能对所有的对人类皮肤有潜在致敏性的物质或者所有相关的物质都合适。选择实验方法时，要考虑各种因素，例如测定物的物理特性，包括其对皮肤的刺激性。两种使用天竺鼠的实验正在发展：一种是佐剂类型，在完全佐剂(FCA)下，强行消除或延缓测定物对过敏症状的作用；另一种是非佐剂类型。佐剂类型实验比其它不使用完全佐剂的实验更能准确预计人类皮肤对物质作用作出的敏感反应。天竺鼠极限化测试(GPMT)是辅助类型的实验。尽管还有其它一些实验方法可以测定物质引起皮肤敏感反应的能力，GPMT仍是最可取的辅助类型的方法。关于物质化学特性的分类有多种，非佐剂类型（Buehler实验较佳）被认为灵敏度较差。在某些情况下，更适宜采取进行局部注射的Buchler实验，而不是使用天竺鼠极限化皮肤注射的实验。当使用Buchler实验的时候，应给出科学理由。这个实验同时描述了GPMT方法和Buchler方法。只要可行和有科学的根据，也可使用其它方法。如果在一个公认的实验中观察到阳性现象，应指出测定物是潜在的感光剂，同时不必做进一步的天竺鼠实验。然而，如果在实验中观察到负反应现象，则要使用本实验所描述的方法进行天竺鼠实验。见描述部分B.1.2.定义皮肤过敏：（过敏性皮肤炎）是皮肤对物质的免疫反应。对于人类来说，这种反应可分为瘙痒，红斑，水肿，丘疹，小囊或这些症状的综合。在其它物种中，反应现象可能不同，可能只有红斑和水肿。接触感应：让实验动物接触一段时间，使其对测定物产生过敏性反应。感应时间：接触感应后至少维持一星期，让过敏性症状形成。接触质疑：让先前涂了诱导处理过的测定物的动物接触一段时间，以确定此动物是否产生过敏性反应。1.3.标准物质每六个月，用已知的对皮肤有轻度到中度过敏刺激的物质测定实验技术的灵敏度和可信度。在准确进行的实验中，辅助类型的实验应有30％，非辅助类型的实验应有15％的轻度到中度过敏反应现象。建议使用以下物质。CAS实验数据EINECS实验数据EINECS名称普通名称101-86-0202-983-3α-己基肉桂醛α-己基肉桂醛149-30-4205-736-82-巯基苯并噻唑(快热粉)kaptax94-09-7202-303-5苯唑卡因norcaine在有合适理由的情况下，可以使用其它符合以上标准的物质。1.4.测定方法原理测定物通过皮内注射和/或表皮注射注入实验动物。注射一定刺激量测定物后休息10到14天（诱导期），在这期间免疫反应渐形成。将经过接触刺激的动物与注射了刺激性测定物而在诱导阶段未经处理的对比动物样品的皮肤反应的范围和程度进行对比。1.5.测定方法描述如果测定物需要被清洗，应使用水或合适的溶剂，避免改变已有的反应和损害表皮的完整性。1.5.1.天竺鼠极限化测试(GPMT)1.5.1.1.预备健康的年轻成年白公天竺鼠应至少在实验前5天开始适应实验室条件。实验前将动物随机分成几组。根据实验使用方法，将动物样品的毛剪去，剃去或可能的话用化学方法除去。小心避免损伤皮肤。实验开始前和结束后将动物称重。1.5.1.2.实验条件1.5.1.2.1.实验动物通常使用实验室饲养的白公天竺鼠。1.5.1.2.2.数量和性别可用雄性和/或雌性动物。如果使用雌性动物，其应是未生育和非怀孕的。实验组至少有10只动物，对比组至少包括5只动物。当使用少于20只实验动物和10只对比动物和不能确定测定物是否一种感光剂时，建议附加使用至少20只实验动物和10只对比动物实验。1.5.1.2.3.试剂浓度用于每个接触感应阶段的测定物的浓度应是能被组织忍受和引起轻度到中度皮肤发炎的最大量。用于接触刺激阶段的浓度应是不引起发炎反应的最大量。如果得不到其它信息，应用2到3只动物进行实验性测定以确定最佳浓度。若使用FCA处理的动物应仔细考虑测定物的浓度。1.5.1.3.步骤1.5.1.3.1.前言第0天，实验组在动物样品的两边肩膀皮内注射三种物质，每种0.1毫升，肩膀应脱净毛，以使每种注射的物质位于身体中线对称的两边。注射物1：FCA与水或生理盐水1：1（体积比）混合物。注射物2：合适的状态和浓度的测定物。注射物3：合适浓度的测定物与FCA/水或生理盐水的1：1（体积比）混合物。对于注射物3，水溶性物质应溶于水然后再与FCA混合。脂溶性或非水溶性物质悬浮与FCA中与水相结合。测定物的最后浓度应与注射物2中使用的相等。注射物1和2注射在离头部最近处，彼此相邻，而注射物3注射在测定部分的尾部。第0天，对比组皮内注射三种物质，每种0.1毫升，注射在与实验组动物相同的部位。注射物1：FCA与水或生理盐水1：1（体积比）混合物。注射物2：未冲淡的媒介物注射物3：50％的媒介物与FCA/水或生理盐水1：1的混合物。第5－7天，实验组和对比组如果测定物不是皮肤刺激性的，在局部诱导的约24小时前，剪去或剃去毛的测定部分应用0.5毫升10%的用凡士林处理的硫酸钠，以使其产生局部发炎。第6－8天，实验组除去实验部分的毛。将覆盖了最佳形态的测定物滤纸（2×4厘米）贴于动物样品的实验部分，绑上绷带48小时。应选择合适的媒介物。固体应先碾碎制成合适的形态。可能的话，第6－8天，对比组除去实验部分的毛。用同样的方法将赋形剂贴于动物实验部分，绑上绷带48小时。1.5.1.3.2.刺激第20－22天，实验组和对比组除去实验组和对比组动物侧腹上的毛。将测定物涂于动物样品的一边侧腹，另一边侧腹涂媒介物。用绷带固定24小时。观察和评级：实验组和对比组在移去补丁约21小时后,如有必要需清洁挑战部位并仔细剪或刮使脱毛。再过大概3小时后,也就是离开始测定其应用性48小时左右,可观察到皮肤反应,并根据附录中的程度等级做记录。离这次观察约24小时后,再进行一次72小时观察和记录。对测定组和对照组动物样品的盲读是被支持的.如果有必要阐明第一次测定的结果,那么在上次测定的约一星期后就要考虑又一次测定.下次测定也需用原来的对照组。所有来源于实验进程的皮肤反应以及任何异常现象,包括全身反应都要观察并根据Magnusson/Kligman（见附录）衡量等级记录下来。可以进行其它过程如历史病理检查,皮肤折层厚度测量等,以此来阐明一些可疑反应。1.5.2.Buehler测定1.5.2.1.准备工作在测定前让健康年轻的成年白化天竺鼠在实验室环境中至少适应5天。并且这些动物事先随机分配到治疗组。根据实验方法的不同,选择或剪或刮或用化学脱毛剂的手段来去除动物毛发,且要小心勿弄伤皮肤。测定的开始和结束分别称下动物体重。1.5.2.2.测定情况1.5.2.2.1.测定动物通常使用实验室品种的白化天竺鼠。1.5.2.2.2.数量和性别雄性的或雌性的动物均可使用。如果使用雌性的动物必须是从未生育过的或未怀孕的。实验组中最少要20只动物,对照组中至少要10只。1.5.2.2.3.剂量标准用于每个引导接触的测定物质的浓度时能产生温和但不过度刺激的最高量。而用于免疫性试验接触的浓度是不引起刺激的最高量。有必要的话可用2、3个动物做个试点实验来得到合适的浓度。对于水溶性的测定物质，水或稀释的无刺激性的界面活性剂溶液可用作载体。对于其他测定物质，乙醇/水用于诱导阶段，丙酮用于免疫性试验阶段。1.5.2.3.实验步骤1.5.2.3.1.诱导阶段0天-实验组清除一侧毛发（仔细修剪）。实验补丁系统应准备好充足的已溶在合适载体中的测定物质（必须证明载体选择的正确性；如果合适的话，液态的测定物质无需稀释即可应用）。实验补丁系统应用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件合适的敷料与皮肤保持6小时联系。实验补丁系统必须是封闭的。一块可方可圆的棉衬垫正合适，但大小需约4-6平方厘米。使用一个合适的束缚物来约束能确保封闭。如果使用包装可能会造成额外的接触。对照组清除一侧毛发仔细修剪载体应用类似于上述测定组实验补丁系统应用于测定区域并且通过一个封闭的补丁或腔和一件合适的敷料与皮肤保持6小时联系。如果能证明不需要一个阴性对照组，可使用阳性的对照组。6-8天和13-15天-实验组和对照组在第6-8天以及第13-15天在相同侧边的相同测定部位进行和0天一样的操作（如有需要清除毛发）。1.5.2.3.2.免疫试验阶段27-29天-实验组和对照组清除实验组和对照组动物先前没经处理的一侧毛发（仔细修剪）。把一个含有适量测定物质的密封的补丁或腔应用于实验组和对照组动物原来没受处理的一侧，药物浓度是不引起刺激的最大量。当相关时，一个含载体的封闭的补丁或腔也应用于实验组的对照组先前没受处理的一侧。通过一件合适的敷料保持6小时接触。1.5.2.3.3.观察和评级在移去补丁约21小时后，清理测定部位的毛发。约3小时后（在应用实验补丁约30小时后），观察皮肤反应并根据附录中的等级标准做记录。在观察30