三少-基因工程的基本操作步骤

基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物另一种生物的遗传特性一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因基因是什么结构?2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子启动子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因基因是什么结构?2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成(1)从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？概念：基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包包含了一种生生物所有的基因,这种基因文文库叫做基因因组文库.部分基因文库库:基因文库中包包含了一种生生物的一部分基因,这种基因文文库叫做部分分基因文库.提取某种生物物的全部DNA用适当的限制制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段段与载体连接接导入受体菌中中储存基因组文库基因文库的构构建方法（1）直接分分离法(鸟枪枪法)某种生物的单单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中中储存与载体连接cDNA文库库反（逆）转录录酶DNA聚合酶酶（2）反（逆逆）转录法：：cDNA的的合成流程图图解基因文库的构构建方法某种生物某个个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库库一、目的基因因的获取1、目的基因因主要是指______________________编码蛋白质的的结构基因请举出三个以以上的例子2、获取目的的基因的常用用方法（1）从基因因文库中获取取（2）利用PCR技术扩扩增利用PCR技技术扩增目的的基因PCR——聚合酶链链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合合成技术。通过此技术术，可获取大大量的目的基基因。PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪仪DNA复制一段已知目的的基因的核苷苷酸序列：以_____方式扩增增，即____（（n为扩增循循环的次数））指数2n模板DNA；；DNA引物物；四种脱氧氧核苷酸；热热稳定DNA聚合酶（Taq酶）过程变性、退火、、延伸三步曲曲变性：加热至90～95℃双链DNA解解链成为单链链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模模板的单链DNA的特定定互补部位相相配对和结合合延伸：加热至70～75℃以目的基因为为模板，合成成互补的新DNA链变性退火延伸2、具体过程程一、目的基因因的获取1、目的基因因主要是指______________________编码蛋白质的的结构基因基因是什么结结构?2、获取目的的基因的常用用方法（1）从基因因文库中获取取（2）利用PCR技术扩扩增（3）人工合合成人工合成——根据已知知的氨基酸序序列合成DNA蛋白质的氨基基酸序列mRNA的核核苷酸序列结构基因的核核苷酸序列推测推测目的基因化学合成1、目的基因因的获取2、基因表达达载体的构建建基因工程基本本操作的四个个步骤使目的基因在在受体细胞中中稳定存在，，并可进行遗遗传、表达和和发挥作用3、将目的基基因导入受体体细胞4、目的基因因的检测与鉴鉴定二、基因表达达载体的构建建——核心（1）用一定定的_________切割质粒，，使其出现一一个切口，露露出____________。（2）用___________切切断目的基因，使其其产生_________________。（3）将切下下的目的基因因片段插入质质粒的______处，，再加入适量量___________，形成了了一个重组DNA分子（（重组质粒））限制酶黏性末端同一种限制酶酶的黏性末端切口DNA连接酶酶相同1.过程:基因表达载体体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末末端两个切口获得目目的基基因DNA连连接酶酶重组DNA分子子（重重组质质粒））同一种种限限制酶酶目的基基因与与运载载体的的结合合过程程，实实际上上是不不同来来源的的基因因重组组的过过程。。2、基因表达载体的作用a、使使目的的基因因在受受体细细胞中中稳定存存在并遗传给给子代代b、同同时使使目的的基因因能表达和和发挥挥作用用思考：：作为基基因工工程表表达载载体，，只需需含有有目的的基因因就可可以完完成任任务吗吗？为为什么么？基因表表达载载体的的组成成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基基因的的首端端,是是mRNA聚合合酶结结合位位点位于基基因的的末端端,终终止转转录检测目目的基基因是是否导导入受受体细细胞它们有有什么么作用用？1、目目的基基因的的获取取2、基基因表表达载载体的的构建建3、将将目的的基因因导入入受体体细胞胞基因工工程基基本操操作的的四个个步骤骤载体进进入受受体细细胞稳稳定表表达，，才能能实现现一种种生物物的基基因在在另一一种生生物中中的转转化。。常用的的受体体细胞胞：有大肠肠杆菌菌、枯枯草杆杆菌、、土壤壤农杆杆菌、、酵母母菌和和动植植物细细胞等等。将目的的基因因导入入受体体细胞胞的原原理借鉴细菌或或病毒毒侵染染细胞胞的途径径。三、将将目的的基因因导入入受体体细胞胞1、将目的的基因因导入入植物物细胞胞（1））农杆杆菌转转化法法特点:能感染染双子叶叶植物物和祼子植植物,对单单子叶叶植物物无感感染能能力Ti质质粒的T——DNA可可转移移至受受体细细胞并并整合合到其其染色色体上上转化过过程:Ti质质粒目的基基因构建表达载载体导入植物细细胞插入植物细细胞染染色DNA表达新性状状转入农杆菌菌（2））基因因枪法法基因枪枪法又又称微微弹轰轰击法法，是是利用用压缩缩气体体产生生的动动力，，将包包裹在在金属属颗粒粒表面面的表表达载载体DNA打入入受体体细胞胞中，，使目目的基基因与与其整整合并并表达达的方方法。。（3））花粉粉通道道法植物花花粉在在柱头头上萌萌发后后，花花粉管管要穿穿过花花柱直直通胚胚囊。。花粉粉管通通道法法就是是在植植物受受粉后后，花花粉形形成的的花粉粉管还还未愈愈合前前，剪剪去柱柱头，，然后后，滴滴加DNA（含含目的的基因因），，使目目的基基因借借助花花粉管管通道道进入入受体体细胞胞。2、将将目的的基因因导入入动物物细胞胞①方法：：显微微注射射法②程序：：目的基基因表表达载载体提提纯取取卵（（受精精卵））显显微注注射受受精卵卵新新性状状动物物3、将目的的基因因导入入微生生物细细胞常用法法：Ca2+处理常用菌菌：大肠肠杆菌菌微生物物作受受体细细胞原原因：：繁殖快快、多为为单细细胞、、遗传传物质质相对对少过程：：Ca2+处理大肠杆杆菌感受态态细胞胞表达载载体与与感受受态细细胞混混合感受态态细胞胞吸收收DNA1、目目的基基因的的获取取2、基基因表表达载载体的的构建建3、将将目的的基因因导入入受体体细胞胞4、目目的基基因的的检测测与鉴鉴定基因工工程基基本操操作的的四个个步骤骤才能确确定目目的基基因是是否真真正在在受体