基因操作工具酶

第一节基因工程操作中使用的工具酶

第二节核酸的分离纯化

第三节聚合酶链式反应（PCR）

第四节凝胶电泳系统

第五节核酸的分子杂交

第六节载体系统第十章分子生物学实验技术

第一节基因操作工具酶酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ

TaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY1限制性核酸内切酶1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义1.2限制性核酸内切酶的命名1.3限制性核酸内切酶的分类1.4限制性核酸内切酶活性及其影响因素Home核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1）按作用对象可分为:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为：Endonuclease&Exonuclease1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。

限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。Back1.2限制性核酸内切酶的命名命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ从大肠杆菌（Escherichiacoli)R株分离的第一种限制酶命名为EcoRⅠ，其中E代表属名（Escherichia)，co代表种名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表该菌株中首次分离到。Back1.3限制性核酸内切酶的分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ

型限制性内切酶1.3.3Ⅲ

型限制性内切酶1.3.1型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）；应用：不常用。1.3.2Ⅱ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处。应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。1.3.3Ⅲ型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。

即通常所指的DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段；应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。Back(1)基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割产生的末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)

和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofselectedRestrictionEndonucleases(2)同功异源酶来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶(isoschizomer),

有时也称同裂酶。如：BamHI

(G↓GATCC)和BstI

(G↓GATCC)

有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。(3)同尾酶有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer)

如：

BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCTBack1.4

限制性核酸内切酶活性

及其影响因素(1)

活性大小：酶对DNA水解程度不同。(2)酶的活性单位：指1μg纯的指定的DNA在指定缓冲液中，于37℃（最适温度更准确）酶解1h完全酶解DNA中所有同一限制性内切酶位点所需的酶量。(3)

影响因素1)DNA模板的纯度2)DNA的甲基化程度3)酶切反应温度4)DNA的分子结构5)缓冲液HomeBack2DNA连接酶2.1定义及功能2.2种类及作用机理2.3使用时的注意事项2.1定义及功能DNA连接酶（DNAligase）：可使一段DNA的3`羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`-磷酸二酯键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形成的切口的酶。OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase连接缺刻(nick)T4DNA连接酶(ATP提供能量）和大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）两种。2.2种类及作用机理T4DNAligase的作用机理DNAligase的活性1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；2)只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。Home2.3使用时的注意事项3DNA聚合酶（DNApolymerase）3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆转录酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶3.1DNA聚合酶I活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3`-端游离羟基的引物链（3）底物和激活剂注：对双链DNA，当有dNTP存在时，3`→5`降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑制。应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制备DNA分子探针活性：

5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性，无5`→3`外切酶活性。用途：（1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端；（2）催化合成cDNA的第二链；（3）DNA序列测定3.2Klenow聚合酶EcoRI酶切末端同位素标记的EcoRI酶切末端α-32P-dATP显著特点：热稳定性

70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。应用：（1）DNA序列测定（2）PCR(polymerasechainreaction)对DNA的特定片段进行体外扩增。3.3TaqDNA聚合酶逆转录酶(reversetranscriptase)：又称为RNA指导的DNA聚合酶。活性：

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。3.4逆转录酶逆转录酶的活性

用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。

高浓度dNTP环竟下前者活性更强。应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端注意：3`外切酶活性无序列特异性3.5T4DNA聚合酶活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；（3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端。3.6T7DNA聚合酶Home4修饰酶4.1碱性磷酸酶4.2末端转移酶4.3T4多核苷酸激酶4.4S1核酸酶

Home4.1碱性磷酸酶功能：

催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。来源：

有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)。碱性磷酸酶的活性

注意：

CIP的比活性比BAP的高出10-20倍，CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。末端转移酶(terminaltransferase):

是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：

催化5`脱氧核苷三磷酸进行5`→3`方向的聚合作用,逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。4.2末端转移酶末端转移酶的催化作用

用途：

(1)主要用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；

(2)标记DNA片段的3`末端。4.3T4多核苷酸激酶来源：T4polynucleotidekinase来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5`-OH末端（图）。T4多核苷酸激酶的活性（正向反应）D