第二届遗传咨询师培训-4

PCR、RT-PCR、实时PCR、RT-PCR、实时东东华大学生物科学与技肖君华博士教授 多聚酶（PCR：PolymerasePCR是由科学家穆利斯一种体外简化条件下模拟DNA体内的DNA快 理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成KaryB.

1.autoclavedultra-filtered(pH2.10xPCR3.dNTPsmix(25mMeach200µM4.primermix(25pmoles/µLeach0.4µM(each5.TaqDNApolymerase(native1Unit/256.genomicDNAtemplate(100100*The10xPCRbuffercontains:500*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mM 高温变性低温退火适温延 重复1～325～30

2条变单2 DNA单

DNA

扩增100万倍以

DNA双螺 时间11PCR反应成11PCR反应成模-形式、双链DNA均-纯度蛋白、多糖、酚类等抑制PCR-浓度一般100ng/100L，过高会导致非特异性扩增-完整性模板降解会导致PCR扩增无产引-设计长度适当、避免二级结构和二-完整冻-浓度0.1-1.0mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降；低扩增-补足体系，pH值适当，避免（4）反应-pH、盐离子、稳定剂、增强-提供缓冲环-浓度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶的激活剂。浓度过低使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；过高非特异严-可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度响反应中游离的Mg2+-浓度一般20-200mol/L，四种应相等，浓度取决于扩增-避免反复冻TaqDNA合0.5-2.5U/50l，酶量增加使反应特异性下量过少影响反应产量。2）PCR2）PCR 变-使双链DNA-93-95℃，20-30-变性温度低、解链不完全是PCR实验失败主要退-温度40-60℃，由引物长度和GC含量决定，一般Ta=Tm--增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度可增加反应的灵敏-时间30-60延-温度70-75℃,一般为72℃，温度过高不利于引物与模板结-时间由扩增片段长度决定，1kb以内，1min足够，延伸时间过长引起非特异，但循环-主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35-次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增引引引PC反 长引物的长度一般为15-30bp，通常18-24bp，但长片段扩增时，引物长度30-35bp 组上存在的退火位点只有1/400个GC含 结尽量避免引物序列形成发夹，特别是3尽量避免引物间形成二聚体、特别是3’端前3个碱基间不能有二聚体错3‘端尤其不要形成非引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错 5.0（自动搜索Oligo6（引物评价）VectorNTISuitPrimer3

5.0使用简 .cn主页 中 5.0使用步 5.0评价引物方 无扩增非特异拖污无扩增产现象：正对照有条带，而样品

样品 样现象：条带与预计的大小不一因更换更换拖现象：产物在凝胶上呈现象：产物在凝胶上呈smear状原因污 现象：空白对照出现目的扩增更 巢式PCR（Nest-递减PCR（TouchDown热启动PCR（HotStartPCR巢式PCR（Nest- 增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵提 PCR（如5‘RACE）特异性递减PCR（TouchDownPCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm5℃。 热启动PCR（HotStart热启动PCR（HotStart热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直PCR仪达到变性温通常选择热启动TaqPCRPCR甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等均可充当PCR的增强剂物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构将RNA的反转录（）cDNA（PCR）相结合的RNAcDNcDNART-PCR是目前从组织或细胞中获得目 以及对已知序列的RNA行定性及半定量分析的最有效方法 反反转录（reverse以RNA为模板，合成与其互补的的过程反转录酶（依赖RNA的DNA聚合RNA指导的DNA聚合酶活RNA水解酶活DNA指导的DNA聚合酶活模组织或培养细胞引oligodT、随机引物 特异性引反转AMV、M-MLV、SuperRNaseHReverseTranscriptaseQuantReverseRNA酶抑制底等浓度的四种反应环缓冲液（RT随机引物特异性引物 Moloney鼠白血 SuperRNaseH-ReverseQuantReverse……33Poly(A)*TTTSuperReverseTTTcDPCR扩TTT…一步…Poly(A)*SuperReverseTTTTTTPCR扩两步法与一步法RT-PCR引OligodT，随机引物优PCR扩增失败时便于分析原因各自在最优化条件下进行，反应效率cDNA可长期保特异性和灵敏度简便操作，污染几率适检测多种目半定量RT-适合、病原菌检大量样品分定-纯度OD260/280=1.8--完整性 18S两倍以上-分离过程中避免RNase的污 无扩增非特异拖无扩增产现象：正对照有条带，而样品因原因分离高质量的分离高质量的

样品 样品 正对目 策1.2或采用touchdown1.2或采用touchdown现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性因原因 拖 现象：产物在凝胶上呈smear1.减少cDNA1.减少cDNA2提取高质量的RNA内含子，防 获得目RNA定性与半定量 实时（RealTime1992年由一位人Higuchi第一次重现性积实时监测目的扩增的技术，通过Ct值与标准曲线的处 非特异性荧光标1、SYBR特异性荧光标2、 荧光素3、Molecular荧光素方法1----SYBRGreen 工作机SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部SYBRSYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧变性时，DNA双链分开，无荧 方法1----SYBRGreen 工作机

No

/方法1----SYBRGreen 优缺/应条件改变，meltcurve是必法2----Molecular 工作机标记荧光的发夹茎由互补配对序列组成5-7个核苷方法2----Molecular 优缺优 缺高特高特SNP最灵敏的试剂只能用于一个特定目设价格比较方法3----TaqMan 工作机VIC®,JOE™,NED™,CY3™,TexasRed®3′端标记有荧光淬灭(QuencherQ)TAMRAMGBnon-fluorescent)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收无荧光；R与Q分开，发荧每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信可以在循环过程中检测荧方法3----TaqMan 优缺优 缺 某 扩增曲横坐横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强每个循环进行一次荧光信号的收 基线基线确认之后所有样品基线都被设置为

所有样品信号都从同一个起点开始计 荧光阈值缺省设置是3～15号的标准偏差的10自动（手动）设置 Ct 标准曲E本次循环的扩增效率0≤E≤1E=[10（-1/s）-1] lgC 为常数,从以上公式看出样本lgC和Ct值n成线性模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越C

定-DNA-RNA定定-SNP -RNA变异分-熔解曲-阴阳性1绝对检测起始模板数的精确拷贝数，通常用标准曲线至少5个不同浓度梯度标准品，浓度涵盖未知样本浓每个点3重加入NTC，检测可能的污未知样本Ct值代入公式，得到起始浓度252）相对定确定经过不同处理的样本目标转录本之 的表达差异 不用内 均一化处以内 做为标均一化表 简–假设100目 相对偏差不超过PfafflVandesompele多个内 均一 复ΔΔCT的应用范第一步ΔCT校准样品=样品-内参=27.35-第二步ΔCT待测样品=样品-内参=27.52-第三步ΔΔCT=ΔCT待测样品-ΔCT校准样品=10.66-第四步2-ΔΔCT=2-miRNA特Shortsequence(18-BackgroundfromcontaminatingsmallRNAs(tRNA,rRNA,snRNA) Highlyhomologous-manymiRNAshaveasinglenucleotidedifferencemadethemelusiveandchallengingtomiRNA检测方法比NorthernBlot（杂交法需大量样品（ug级 法需大量RNA样品，约5ugper很难区分前体miRNA和成熟

tativeReal-Time只需微量样非常宽的动力学范围高灵敏度，高特异Mature-poly(A)addedandSamecDNApreparationfromonetubecanconvertanymiRNAMatureandprecursorLesssample无法分辨maturemiRNA的具体形Mature-TaqManstem-loopRT-基本流Precursorsandpri-RT-RTrandomhexamersorgene-specificprimersGreenforwardRedreverseBluesenseGreen+Redpri-miRNAandRed+Bluepri-miRNAficationofpri-andpre-miRNA=2-CT(pri-miRNA+miRNA)-2-CT(Pri-多重 竞争竞争竞争性PCR是 竞争PCR—在PCR扩增过程中，PCR产物的量用公式Y ,扩增效率一致。最终混合PCR产物中，待分析样参 目 目 ctac ctac

目 ctac

样本cDNA（ ctacac ctacac

ctacac 多重嵌合特异引物竞争性PCR扩增

ctacac 内对照DNA（ 因基因

ctac