比较草鱼与团头鲂消化道微生物群落结构特征差异,渔业论文

比较草鱼与团头鲂消化道微生物群落结构特征差异,渔业论文宿主消化道中生存着大量的微生物,经过长期的共进化,这些微生物与宿主之间构成了相对稳定的互利共生关系。一方面,宿主消化道为各种微生物提供相对稳定的生存环境和持续的营养物质供给;另一方面,消化道微生物也直接或间接介入宿主的发育、营养、免疫等众多生理生化经过。近年来,食物组成对消化道微生物群落构造和功能的影响成为研究热门。如Li等通过对受试人员食谱中添加十字花科蔬菜发现其显著影响了人类粪便样品中的微生物群落构造。Kocherginskaya等通过使用两种不同成分的饲料喂养公牛探究其瘤胃中细菌类群变化,研究结果表示清楚两种饮食条件下公牛瘤胃内微生物群落差异显著,饲喂玉米的公牛瘤胃中的微生物在数量和种类上都明显高于饲喂干草的公牛瘤胃中的微生物。不仅在陆生脊椎动物,在水生脊椎动物鱼类中同样有类似的研究报道,如Ring等以5种不同食物组成的饲料对大西洋鲑鱼进行为期28d的投喂实验,对华而不实肠和后肠的微生物菌群进行分析,结果显示不同饮食条件下大西洋鲑的肠道菌群构造存在差异。McKellep等对大西洋鲑分别投喂含有大豆饼、菊粉和氧四环素的饲料,结果显示后肠中附着菌群存在差异,华而不实投喂大豆饼组鱼体后肠内附着菌群不仅数量上更多,而且具有更高层次的菌群构造多样性。以上研究结果表示清楚无论在陆生脊椎动物还是水生脊椎动物,宿主食物组成都是影响其消化道微生物群落的重要因素。在水生脊椎动物中,草食性鱼类以其能以陆生或水生植物为主要食物来源而成为重要研究对象,本文以淡水草食性鱼类为研究对象,探寻求索这一特殊食性鱼类的消化道微生物菌群构造。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和团头鲂(Me-galobramaamblycephala)为典型的草食性鱼类,且草鱼是当前世界上产量最大的淡水经济鱼类团头鲂是我们国家特有的优良淡水鱼类,它们不仅在我们国家淡水养殖中占据重要地位,在维持淡水生态系统的平衡方面也有重要作用。本研究以湖泊天然水体养殖的草鱼(Cteno-pharyngodonidellus)和团头鲂(Megalobramaambly-cephala)为研究对象,采用PCR-DGGE指纹分析结合DNA测序技术比拟分析其消化道微生物群落构造特征,希望能为深切进入阐述草食性鱼类消化道内特定微生物菌群介入营养物质代谢提供参考。1、材料与方式方法1.1采样点大概情况武汉市武湖(N3047?,E11428?),位于湖北省武汉市黄陂区境内,为长江中游中型浅水富营养化湖泊,湖区面积约20km2,最大水深4.2m,平均水深2.6m。水生植被覆盖率为30%40%,据夏文凯等研究,武湖水生维管束植物主要有4科5种,沉水植物主要有聚草(Myriophyllumspicatum)、苦草(Vallisneriaspiralis)、金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)、菹草(Potamogetoncrispus)。1.2样品采集本实验所用草鱼、团头鲂于2020年11月21日采自武汉市武湖(表1),选取大小相近个体各三条,活鱼充氧运回实验室后立即在无菌条件下进行解剖,分别剪取前、中、后肠,用无菌水冲洗肠内容物并收集于2mL无菌离心管中。1.3肠道微生物总DNA提取草鱼和团头鲂消化道微生物中DNA提取参考Ni等,即向每管肠道内容物中参加1200?L裂解液(10mmol/LTris-Cl;0.5%SDS;100mmol/LEDTA;0.1mg/mL蛋白酶K;50g/mLRNaseA),于55℃中水浴裂解12h;室温离心后取上清转入新无菌离心管中采用常规酚-氯仿法进行抽提,随后用4℃保存的70%酒精洗涤3次后自然风干,风干后的DNA重悬于100?L无菌双蒸水中,保存于20℃备用。1.4PCR扩增采用细菌16SrRNA基因通用引物F357-GC(5?-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3?)和R518(5?-ATTACCGCGGCTGCTGG-3?)对肠道内容物样品中细菌类群进行PCR-DGGE分析。PCR反响体系为每25?L反响混合液包含:2.5UTaqDNA聚合酶(Fermentas,美国),80?mol/LdNTP(Fermentas,美国),2mmol/LMgCl2(Fermentas,美国),正反向引物各0.2mol/L,1buffer(Fermentas,美国),细菌DNA模版2L。PCR反响在S1000TM热循环仪(Bio-Rad,美国)上进行,反响条件为:94℃预变性10min;随后进行10个循环的降落PCR(94℃变性45s,6859℃退火30s,每个循环降低1℃,72℃延伸1min);然后再进行25个循环的常规PCR扩增(94℃变性45s,58℃退火30s,72℃延伸1min);最后72℃延伸10min。取5?LPCR产物用浓度为1.5%的琼脂糖胶100V稳压电泳30min以检测PCR扩增效果。1.5变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析PCR扩增所得产物在9%(w/v)胶浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,变性范围为40%70%,电泳条件为60℃条件下120V预电泳10min,然后100V稳压电泳12h。凝胶用1SYBRGold染色30min后在BIO-RADGelDocXR+凝胶成像系统(Bio-rad,美国)下成像。1.6测序从变性梯度凝胶上回收需要测序的条带,加100?L无菌水溶解,取2?LDNA模版用不带GC夹板的引物F357和R518进行PCR扩增,PCR扩增条件同上,PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen,美国)进行回收纯化,纯化后的DNA片段用pMD18-T载体(TaKaRa,日本)转化入EscherichiacoliDH5菌株培养后进行PCR检测,合格的菌斑送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。1.7数据分析采用QuantityOne4.6.2(Bio-Rad,美国)软件导出变性梯度凝胶电泳图谱条带丰度数据矩阵。借助XLSTAT-Pro7.5软件根据条带丰度值做UPGMA聚类分析,并运用canoco4.5软件对数据进行PCA分析。测序所得序列运用NCBI中VecScreen工具除去载体,再次去除引物后将所得序列结果在RDP数据库中进行比对。运用ClustalX(version1.83)和MEGA安装包(4.0)构建系统发生树,采用邻接法(NJ)进行分析,并进行1000次重复的bootstrap验证。2、结果2.1DGGE指纹图谱针对细菌16SrRNA基因进行的DGGE图谱分析共检测到91种DGGE带型(图1)。华而不实有30条谱带仅在单个泳道检出,没有检测到在所有泳道都出现的共有条带。草鱼消化道内检测到的平均谱带数为(33.32.8)条,团头鲂消化道检测到的平均谱带数为(38.02.5)条。2.2消化道微生物群落构造比拟UPGMA聚类分析显示草鱼消化道微生物群落并没有完全与团头鲂消化道微生物群落分开;相比于草鱼和团头鲂消化道微生物群落之间的差异,草鱼和团头鲂个体间差异愈加明显,而且草鱼消化道微生物群落的个体分化更为明显,如1号草鱼样品、2号草鱼样品、3号草鱼样品分别聚为不同的聚类枝,而团头鲂则只要6号样品聚为一支,并嵌入到4号前肠和5号后肠聚的进化枝中;4号团头鲂其他样品与5号团头鲂其他样品则没有很好地分开。PCA排序结果同样显示除了1号草鱼样品和6号团头鲂样品与其他样品不同之外,其他的样品都没有很好地区分开,这一结果同样讲明草鱼和团头鲂消化道微生物群落构造并没有明显地分开。2.3DGGE谱带测序分析本实验一共测得24条DGGE条带对应的DNA序列(表2)。将所得序列进行RDP数据库比对,置信度阈值为80%。结果显示草鱼消化道内菌群主要是-变形菌门(-Proteobac-teria)、梭杆菌门(Fusobacteria)还有少量厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);团头鲂消化道内菌群与草鱼类似,主要为-变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门,但未检测到拟杆菌门细菌。华而不实,气单胞菌属和Cetobacterium属细菌是草鱼和团头鲂消化道中的优势菌群;另外,团头鲂消化道内还检测到魏斯氏菌属、明串珠菌属和假单胞菌属细菌,但未检测到拟杆菌门细菌。同时结合RDP和NCBI数据库比对结果运用MEGA安装包(4.0)构建NJ系统发生树。3、讨论宿主消化道内生活着大量的微生物,就人类而言,消化道内微生物细胞在数量上至少是人类体细胞数量的十倍。这些微生物生态系统在宿主体内发挥着重要的生理功能。当前为止,国内外学者已对动物消化道微生物开展了广泛深切进入的研究,如Rawls等以无菌斑马鱼为模型研究其消化道微生物时发现,斑马鱼消化道内微生物能够调节肠道212个基因的表示出,且华而不实一部分能够刺激上皮细胞增殖、促进营养物质代谢和先天性免疫应答。尽管当前已经证实消化道微生物是维持宿主健康不可或缺的因素,但消化道内微生物群落构造并不是固定不变的,宿主的食物组成、生活环境、健康状况等因素都会影响宿主的消化道微生物群落构造,而食物组成对宿主消化道微生物群落构造的影响当前已开展了广泛的研究,并证实宿主的食性和食物组成会对群落构造造成明显的影响,如Ring等对北极嘉鱼(SalvelinusalpinusL.)分别投喂等比例替代的糊精和菊粉饲料,研究结果表示清楚投喂两种食物的北极嘉鱼后肠中微生物组成存在差异,投喂糊精组鱼体后肠中优势菌群为葡萄球菌属(Staphyloco-ccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、微球菌属(Mi-crococcus)、水栖嗜冷杆菌(Psychrobacterglacincola)和链球菌属(Streptococcus),而投喂菊粉组优势菌群为葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Strepto-coccus)、肉杆菌属(Carnobacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)。Syvokien和Mick?nien?对波罗的海沿岸的10种海洋鱼类的消化道微生物群落进行周年跟踪研究,数据显示不同食性鱼类之间的肠道微生物菌群存在显著差异。Ward等通过16SrDNA克隆文库方式方法对南极地区南极鱼科的杂食性鱼类Nototheniacoriiceps和专一肉食性鱼类Chaenoce-phalusaceratus消化道微生物群落进行分析,结果显示杂食性的N.coriiceps肠道微生物多样性比肉食性的C.aceratus丰富。这些研究结果证实了宿主食性和食物组成是影响其消化道微生物群落构造的重要因素。颜庆云等对以浮游生物为主要食物来源的鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)肠含物进行PCR-DGGE分析,指纹图谱的聚类结果显示鲢、鳙并没有完全分开,而是存在穿插。本实验研究结果也显示同为草食性的草鱼和团头鲂消化道微生物群落构造并没有明显的不同,这再次证明食性一样的鱼类消化道微生物群落构造类似,并暗示它们消化道内微生物群落对营养物质的代谢方式可能类似。Han等运用克隆文库方式方法分析了投喂商业饲料的混养池塘内草鱼肠道内容物、池塘水体、沉积物、商业饲料和芦苇的细菌组成,研究发现草鱼肠道内主要菌群为变形菌门、厚壁菌门和放线菌门。Wu等以池塘饲喂黑麦草草鱼为实验对象,通过高通量测序研究发现草鱼消化道内存在核心微生物群落,为变形菌门、厚壁菌门和放线菌门。本实验的测序结果显示草鱼消化道内菌群主要是-变形菌门、梭杆菌门还有少量厚壁菌门和拟杆菌门;团头鲂消化道内菌群与草鱼类似,主要为-变形杆菌、梭杆菌门和厚壁菌门,但未检测到拟杆菌门细菌,这些与前面研究人员的结果基本一致。而且检测到气单胞菌属和Cetobacterium属为草鱼和团头鲂消化道内共有的优势菌群,这一研究结果与Ni等对池塘饲料养殖草鱼和洞庭湖野生草鱼的研究结果一致。以上研究表示清楚来自不同生境的草鱼消化道主要微生物群落组成基本一样,不具有生境特异性,揣测其消化道内存在核心微生物组成。在研究杂食性鱼类中,薛恒平等报道杂食性鱼类消化道内优势菌群为弧菌和气单胞菌;周金敏通过对肉食性鱼类黄颡鱼肠道菌群分析发现其肠道内的优势菌群为气单胞菌属、肠杆菌科和不动杆菌属;李学梅等对三种室内饲养鱼类肠道微生物群落进行PCR-DGGE分析显示,偏肉食性的斑点叉尾肠道中菌群主要属于变形杆菌门,而偏杂食性的银鲫和异育银鲫肠道中主要为梭杆菌门和气单胞属菌。以上针对杂食性和肉食性鱼类的研究