羯布罗香种子 超低温保存技术规程

T/CSMAXXXX－2018羯布罗香种子超低温保存技术规程范围本标准规定了羯布罗香（Dipterocarpus

turbinatus

Gaertn.f.）种子超低温保存过程中的术语和定义、保存种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于羯布罗香种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.6农作物种子检验规程水分测定GB/T3543.7农作物种子检验规程其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。羯布罗香Dipterocarpus

turbinatus

Gaertn.f.为龙脑香科（Dipterocarpaceae）龙脑香属（DipterocarpusGaertn.f.）高大乔木，为珍贵用材树种，从树脂提出的油，商品名为羯布罗香油，油可作调香剂和定香剂，树脂可作药用，叶用于过敏性皮炎、刀伤出血。收载于《中华本草第三册（1999）》。羯布罗香果实Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.fruits羯布罗香其坚果卵形或长卵形，密被贴生绒毛；果萼管无毛，被白色粉霜，增大的2枚花萼裂片为线状披针形，长12~15cm，宽约3cm，具1条多分枝的中脉，沿中脉附近具小突起，无毛。羯布罗香种子Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.seeds羯布罗香的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子褐色，宽卵形，表面粗糙。种子超低温保存seedofcryopreservation指将经过前处理的羯布罗香种子置于液氮（-196℃）中保存。保存种子的选择果实采收5月下旬至6月上旬，花萼变为棕色时即可采收，成熟期较短，于一周内采收完，去除果翅，取出种子。种子选择挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于10℃冰箱中保存备用（存放时间不超过15d）。切取羯布罗香种胚为保存材料。种子前处理生活力检测参照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温（25℃）避光放置4h后观察染色结果。生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数×100%待保存的羯布罗香种子生活力应≥90%。含水量范围用尼龙网袋包裹羯布罗香种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为150:1，室温条件下干燥处理12~26h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由50%~60%降至45%。参照GB/T3543.6中的高恒温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。种子保存量羯布罗香种子保存量不少于300粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式羯布罗香种胚超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的羯布罗香种胚放入放入15mL冻存管（每管2粒种子）中，迅速投入液氮中保存。恢复培养种子解冻处理液氮中至少冻存24h后，取出10个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min。冻后种子生活力检测取出5管解冻后的种子，参照5.1~5.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥60%时视为保存成功。恢复培养将剩下5管解冻后的羯布罗香种胚，播种到MS固体培养基中，温度28℃～30℃，湿度70%～85%条件下培养。羯布罗香种胚出芽周期大概10～20d。附录TTC的配制和保存方法精密称取TTC1.00g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6.5~7.5，置棕色瓶内4℃