姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响 4500字

姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响4500字【摘要】目的:察看姜黄素对肿瘤坏死因子《α〔TNF《α〕引起的血管内皮细胞分泌单核细胞趋化因子《1(MCP《1)的影响.办法：采用原代培养办法获得人脐静脉内皮细胞〔HUVEC〕，随机分为对照组、TNF《α刺激组和TNF《α＋姜黄素组.先用TNF《α刺激血管内皮细胞0.5h，再参加不同浓度的姜黄素(6.25,12.5,25,50和100mg/L)共同孵育1h与单纯TNF《α刺激作对照，采用MTT法、ELISA法和RT《PCR法检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP《1蛋白叙述的影响.结果:HUVEC经TNF《α刺激0.5h后，其MCP《1叙述为159.37±4.47，与对照组94.13±6.07相比明显增强〔P0引言

研究说明，单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白《1〔MCP《1〕来实现,多种物质及细胞因子都可以诱导MCP《1的叙述［1］.肿瘤坏死因子《α通过诱导内皮细胞而产生MCP《1,吸引单核细胞迁入动脉内膜而参与动脉粥样硬化的发生和开展.中药姜黄的有效成分姜黄素具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用，但目前的研究主要围绕其对脂质过氧化的抑制及对细胞间黏附分子《1、血管细胞黏附分子《1和P《选择素等炎性因子的叙述的抑制作用等方面［2-3］,而对血管内皮细胞中MCP《1叙述影响的研究尚少见报道.本实验通过在离体状态下以肿瘤坏死因子《α为诱导因子，察看姜黄素对MCP《1的影响，旨在进一步阐明其爱护内皮细胞，抗动脉粥样硬化的作用机制.

1材料和办法

1.1材料新生儿脐带由第四军医大学唐都医院妇产科提供；倒置显微镜〔日本Olympas公司〕；M199培养基、胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶〔美国Gibco公司〕；胎牛血清〔杭州四季青生物公司〕；姜黄素，TNF《α〔美国Sigma公司〕；噻唑蓝〔北京华美公司〕；兔抗人MCP《1mAb，ELISA试剂盒〔北京中山试剂公司〕；Ⅷ因子多克隆抗体〔武汉博士德公司〕；RT《PCR试剂盒〔大连宝生物有限公司〕；PCR所用引物由上海生工公司合成.

1.2办法

1.2.1人脐静脉内皮细胞〔HUVEC〕的培养及鉴定无菌条件下，取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带约30cm，用PBS反复冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳夹住脐带一端，注入0.4g/LⅠ型胶原酶10mL后夹住另一端，在50mL/LCO2孵育箱中消化30min后收集消化液，1000r/min离心8min后收集细胞，参加含80g/L胎牛血清的M199培养液，接种于25mL培养瓶中，在37℃，50mL/LCO2孵育箱中待细胞生长至融合状态用1.0g/L胰蛋白酶和0.16g/L乙二胺四乙酸混合液消化传代，实验采用第3代细胞，采用SP免疫组织化学染色法［3］检测人第Ⅷ因子相关抗原.

1.2.2噻唑蓝〔MTT〕法察看姜黄素对内皮细胞的作用将对数生长期的细胞按密度为1.0×104/L接种于96孔板中，每孔加100μL细胞悬液，当细胞贴壁后进行药物干涉并在37℃，50mL/LCO2孵箱中继续培养.实验分为对照组：M199培养液；TNF《α刺激组：M199培养液中参加终浓度为10μg/L的TNF《α；TNF《α＋姜黄素刺激组：先参加浓度为10μg/L的TNF《α孵育细胞0.5h，再分别参加终浓度为6.25,12.5,25,50和100mg/L的姜黄素,各组均在37℃条件下孵育1h，每组设4个复孔.实验终止前每孔参加MTT10μL继续培养4h，终止培养.吸弃培养液，每孔参加二甲基亚砜100μL，振荡10min,置酶联免疫检测仪上测定570nm波长处的A值，计算细胞增殖抑制率.计算公式：细胞生长抑制率〔％〕＝〔1-试验组A值/对照组A值〕×100％

1.2.3姜黄素对内皮细胞中MCP《1叙述的影响

1.2.3.1ELISA法检测实验分组同1.2.3主要步骤:在含有兔抗人MCP《1mAb包被的酶标板上,分别参加MCP《1500,250,125，62.5，31.25，15.62,7.81和0ng/L规范品和1∶4稀释的待测细胞上清液各0.1mL,37℃孵育1h；洗板后每孔参加辣根过氧化物酶标记的工作液,37℃孵育1h；清洗后参加邻苯二胺底物液0.1mL,置暗处反馈10min,每孔参加终止液0.05mL终止显色反馈.在酶联免疫检测仪上492nm波长处测各孔A值,每组6个样本,每个样本均设定复孔.

1.2.3.2半定量RT《PCR检测实验分组同1.2.3.按Trizol法提取细胞总RNA.逆转录合成cDNA，MCP《1基因引物：上游5′CTCATAGCAGCCACCTTCAT3′(20bp)，下游5′TCACAGCTTCTTTGGGACAC3′(20bp)；β《αctin引物：上游5′gggACCTgACTAACTACCTC3′，下游5′CAgTgATCTCCTTCTgCATC3′；PCR扩增条件：94℃温育2min，94℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，末次循环72℃延伸10min.反馈结束后15g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值.用目的基因与β《actin基因扩增片段的灰度值之比计算叙述水平.

统计学处理：实验数据均以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件进行方差处理，采用LSD法进行检验,P＜0.05为差别具有统计学意义.

2结果

2.1HUVEC的鉴定相差显微镜下察看细胞大局部贴壁，呈单层扁平梭形相互嵌合或多角形细胞集落，排列呈“铺路石〞样〔图1A〕.经SP染色法后镜下可见细胞胞质丰盛，并呈棕黄色染色颗粒，为阳性反馈，证实细胞来源于HUVEC细胞〔图1B〕.

A：倒置显微镜下×100;B：倒置显微镜下经Ⅷ因子染色×20.

图1原代培养的HUVEC细胞及鉴定〔略〕

2.2黄素对TNF《α损伤后内皮细胞的影响MTT检测显示,TNF《α刺激组中细胞的抑制率为〔31.9±2.8〕%,明显高于对照组〔16±1.0〕%，(P2.3姜黄素对TNF《α损伤状态下内皮细胞MCP《1叙述的影响

2.3.1姜黄素对MCP《1蛋白叙述的影响细胞经TNF《α刺激0.5h后与对照组〔94.13±6.07〕相比，MCP《1叙述明显增加〔159.37±4.47，P2.3.2黄素对MCP《1mRNA叙述水平的影响HUVEC细胞经不同浓度姜黄素和TNF《α分别干涉后β《actin基因的叙述产物几乎保持不变，但目的基因叙述产物在TNF《α组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少〔图2〕.计算结果显示，TNF《α刺激组〔0.493±0.021〕与对照组〔0.197±0.009〕相比拟MCP《1叙述水平明显升高〔PM：markerDL2000；1：对照组；2：TNF《α刺激组；3～7：依次为姜黄素6.25,12.5,25,50和100mg/L不同浓度组.

图2各组MCP《1mRNA叙述RT《PCR扩增产物电泳结果〔略〕

3讨论

姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，本实验以内皮细胞损伤为根底，从MCP《1的角度，在分子水平继续探讨姜黄素爱护内皮细胞的机制［4］.MCP《1作为一种趋化因子,在致炎因子TNF《α作用下可诱导其叙述［5］，MCP《1叙述升高后可引起单核细胞和内皮细胞叙述黏附分子、促进炎症因子的释放，从而介导血管内皮细胞的损伤［6］，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润,而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖,对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用［8］.目前，可抑制细胞中MCP《1高叙述的药物主要有胰岛素、噻唑烷二酮衍生物、二甲双胍、血管紧张素转移酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物等［9］，