加单氧酶系及其诱导作用

———四、真菌的细胞色素P450系统没有一种真菌的加单氧酶系像细菌或酵母一样给与确切的定义。一般来说，它存在于细胞匀浆的微粒体部分，本质上是颗粒状的，需要NADPH,涉及宽泛的生理过程，包括链烷的氧化，生物碱和棒曲霉素的生物合成，以及存在有较广谱的基质氧化能力。目前已鉴定的真菌系统类似于肝脏微粒体P450系统的性质。下面提出关于真菌细胞色素P450系统的几个例证，以帮助理解。Ambike等人使用一氧化碳的差示光谱法从真菌麦角菌(。/研展加purpurea)表明生长培养物的微粒体制剂中证明了细胞色素P450的存在，该菌的加单氧酶系看来，对生物碱的产生有关系。黑根霉(Rhizopusnigricans)含有一种细胞色素P450，它在孕甾酮的11a—羟基化中具有重要意义。一氧化碳抑制该微粒体制剂，同时450nm的紫外光回复了这种抑制，并由CO差示光谱确证了细胞色素P450的存在。真菌Acremonium氧化乙烷为乙酸就是依赖于细胞色素P450，其反应为NADPH激活，并被一氧化碳所抑制。在105000g对Penicilliumpatulum离心，得到两部分制剂。二者都需要氧，NADPH和一种氧化甲苯酚的还原酶，该加单氧酶系为一氧化碳所抑制，并且这种抑制作用被450nm最大光谱的光化学反应的光所作用，而成为可逆的。各种类型的细胞色素P450可能涉及氧化甲苯酚为2,5—二羟基甲苯或3—羟基苯甲醇。Ferris等研究了班尼小克银汉霉(CunninghamellabainieriATCC9244)的力口单氧酶系，使用该真菌的细胞进行转化，发现其加单氧酶系活性几乎同肝脏加单氧酶系所得结果相同。在存在环氧水合酶的条件下，萘被转化成为反式—二氢二醇。a—和0—萘酚的混合物比率为9：1,这接近于使用哺乳类系统的体外体内实验结果。利用这株微生物也观察到了苯甲醚的2—和4—羟基化以及O一去烷基化。但是，成为的比率同哺乳类比较是不相同的。它们对弯孢菌(Curvularia)也进行了广泛的研究，证明对氨基嘌呤的去甲基，对4一硝基苯苯甲醚的O—去烷基的氧化能力，以及还原硝基和偶氮基。该菌的酶系统类似于肝微粒体的加单氧酶系。研究发现需要NADPH和分子氧，被SKF—525A和甲吡酮所抑制，不被氰化物抑制，这就证明了细胞色素P450的存在。该菌的微粒体制剂在450nm的最大吸收呈现出CO的差示吸收谱，这就清楚地证实细胞色素P450加单氧酶系的存在，止匕外，一株雅致小克银汉霉(Cunninghamellaeldgans)类似的细胞色素P450也已经被鉴定。五、酵母的细胞色素P450系统酵母的细胞色素P450以被研究了许多年。各种类型的酵母含有可溶性的或颗粒性的细胞色素，它们一般都需要NADPH，这是一种黄素蛋白还原酶。在有的情况下对整个加单氧酶来说为一脂类成分。对真菌和肝微粒体而言，酵母氧化相当宽泛的基质，它代谢如脂类和脂肪酸这样的化合物，以及如苯巴比妥、乙基吗啡、甲苯异丙基苄胺和氨基嘌呤这样的药物，一般来说，酵母的细胞色素P450加单氧酶系比真菌类似的系统具有更复杂的含义。热带假丝酵母（。即由面tropicalisLM7）就是一例证。它生长在四十烷碳源上，收获细胞经用一种压力装置崩解，使之释放P450。得到三个部分：细胞色素P450，NADPH—细胞色素P450还原酶和一种热稳定性的脂类组分。对脂肪酸和其它基质，包括药物的氧化作用，NADPH和分子氧一起，所有这些都是必需的。值得注意酵母还原酶和脂类都可被鼠肝微粒体相应的组分所替代。因为该物质在100000g不沉降，所以把它看作是可溶性的细胞色素P450。还报导了另外一株热带假丝酵母类似的加单氧酶系。有趣的是，还报导了其它两株热带假丝酵母的加单氧酶系，呈现颗粒状的性质。Yoshida等报导了在厌氧条件下生长的一株酿酒酵母的加单氧酶系。该系统包含同哺乳类肝细胞微粒体同样类型的电子传递组分，包括细胞色素b5,NADH—细胞色素b5还原酶，NADPH—细胞色素C还原酶和一种脂类因子。该系统是颗粒状的，表现为II型和和同巴比妥酸盐及低级醇类变型的基质一结合谱II型。一氧化碳的差光谱专门这类细胞色素最大值在447〜448nm。Aayama等估计了这株酿酒酵母的细胞色素P448的分子量为51000，并指出了用甲基胆蒽诱导肝脏产生的细胞色素同该酵母细胞色素的相似性。微生物细胞色素P450呈现同已知的肾上腺线粒体及肝微粒体系统显著的类似性。所以，微生物和哺乳类在它们氧化代谢药物、外来的化学性异物及形成次生代谢物的发生上的相似性，这就具有坚实的比较生物化学基础。虽然在微生物和哺乳类的细胞色素P450加单氧酶系方面已经获取了相当前面而可取的情报，但是，对它们的生物化学机制了解甚少，特别是通过这种机理进行的生物转化作用，无论是在微生物或在哺乳类，都还有很多工作要作。六、细胞色素P450的诱导作用微生物的细胞色素P450的加单氧酶系是可以由基质诱导的。常常可以观察到这种现象，特别是在通过富集培养术分离到的含有P450的菌种。传统的哺乳类细胞色素P450诱导剂（例如：苯巴比妥、3—甲基胆蒽聚氯联苯）只在微生物P450水平的诱导作用中被适度地应用。在研究过的有限数量的情况下，发现了具有同哺乳类加单氧酶的诱导作用的类似之处。㈠细菌的P450诱导作用有人报导，一株细菌具有可诱导的异香草酸P450的O—去烷基酶系，它对一系列P—烷基苯酯类有活性。荧光假单孢菌(Ps.Putida)的P450cam可被基质樟脑诱导，因为该菌株是最早采用富集培养术，使用樟脑作为唯一碳源。虽然未对该现象作深入研究，但显然该系统不可能是由传统的诱导剂苯巴比妥所诱导，其狭窄的基质专一性似乎不能保证诱导剂的代谢，这种诱导剂对诱导作用是必不可少的物质。一株棒状杆菌(Cory〃仍acteriuMSP.(7E/。)也生长在正己烷的唯一碳源上，维持饱和的气态环境。对生长在其它碳源上与正己烷代谢无关，称为醋酸盐培养物的详细研究结果表明，其细胞色素降低六倍，而这种只是以P420的形式出现。在光谱和催化活性两方面都表现出诱导作用。羟基化酶系的分部分离表明在未被诱导的细胞(在醋酸盐上生长)培养物中缺乏核黄素。Edilson和McMullen(1977)研究了一种普通的肠道微生物区系菌E.coli的O一去甲基酶活性。有关P—硝基苯甲醚的去烷基作用的研究表明，这种活性可以被苯比妥诱导，同未经诱导处理的细胞相比，为1.5倍。该诱导剂仅只略降低细胞的生长。没有发现添加外源性辅助因子的刺激效应，但是一氧化碳的抑制作用是明显的。本研究的重要性在于肠道微生物区系对药物和其它外来化学物质的代谢具有一定关系。药物和其它外来化学物质有助于哺乳类影响消化道微生物对它们的代谢活性。这可能意味着开辟一个新的富有生命力的研究领域。㈡真菌的P450诱导作用产生物碱的麦角菌的P450水平因为由苯巴比妥而加倍增高。其生物碱产量的增加平行于P450的诱导作用。使用3一甲基胆蒽，诱导作用不明显，发现从450到448nm的典型光谱位移。用蛋白质合成抑制剂得到的证据表明，因采用3—甲基胆蒽而出现新的P448的合成作用。麦角菌生物碱生物合成的一种前体物——色氨酸不是作为细胞色素P450的诱导剂，但若使用苯巴比妥却具有增效作用。Ferris等研究Cunninghamellabainieri(ATCC9244)对形成的细胞色素P450的一些诱导剂。出人意料，苯、3－甲基胆蒽、苯巴比妥及巴比妥钠在激活增高苯并芘羟化酶活性方面竟是无活性的。但是，当采用菲作诱导剂时，发现诱导的羟化酶活性增加10倍。可惜的是，这些结果因低的细胞产量而变得复杂化。在哺乳类、芳香烃羟化酶活性是被P448所催化，所以，证明巴比妥酸盐无效，则不足为奇。但奇怪的是：3—甲基胆蒽这种传统的哺乳类P448和芳香烃羟化酶的诱导剂对本菌没有显著影响。因此，深入研究这些诱导剂对本菌在各种不同的P450催化反应方面的效应，可能是有兴趣的课题。Breskvar和Hudnik—Plernik提供了有说服力的证据：他们使用孕甾酮在生长培养物或蔗糖一缓冲液细胞悬物中作为基质诱导出黑根霉的P450酶系—-孕甾酮羟化酶。后一种处理表明了较高的诱导活性。利用放线菌酮作抑制作用的研究发现羟基化作用的增高是因为新酶蛋白的合成作用所致。传统的P450诱导剂对于由C.elegans在萘的代谢方面的影响，已经被研究。这株培养物最初是采用富集培养法使用。如：萘这样的烃类作为唯一碳源，结果萘在由C.elegans的氧化作用中增加了三倍。有趣的是：要知道是否3—甲基胆蒽诱导的是细胞色素P448,而不是P450,因为在苯巴比妥（传统的P450诱导剂）和3一甲基胆蒽（传统的P448诱导剂）之间，在代谢模式上存在着不明显的变化。㈢酵母的P450诱导作用所有的表征说明了热带假丝酵母的细胞色素P450是由正烷烃诱导的。为此，四十烷是最好的碳源。这株酵母是因为它具有利用长链正—烷烃作为唯一碳源的能力而被分离得到。该培养物通常保存在涂布由四十烷膜的琼脂斜面上。Le-Besult等指出羟化酶活性，P450水平，依赖于NADPH的细胞色素C还原酶水平，由于在较大的通气、搅拌，四十烷在介质中的分散作用的条件下，发酵作用全部增高。在该培养物中，葡萄糖并不诱导细胞色素P450。Gallo等所做的研究也得到了同样结果。如果培养物生长在常规基质上，如葡萄糖或醋酸盐上，则缺乏细胞色素P450。烃的诱导酶类同羟基化作用有关。当然，也同醇醛脱氢酶有关。显然，烃类在这株菌中诱导形成了若干其它的氯高铁红素类化合物，然而仍然不知道这些基质的生理意义。Wiseman和Lim发现酿酒酵母的细胞色素P450可以由加到含有少量（0.5%）葡萄糖生长培养基的苯巴比妥所诱导。通常高葡萄糖水平（20％）导致抑制线粒体的合成和细胞色素的产生。当培养基中存在苯巴比妥时，似乎较低的碳水化合物水平有利于细胞色素的产生。当细胞生长在含有20%葡萄糖水平和含有苯巴比妥的培养基上时，不发生细胞色素P450的诱导作用。参考资料.A.H.Rose,editedbyA.H.Rose,“MicrobialEnzymesandBioconversions”；EcononmicMicrobiologyVolume5，Aca