蛋白质生物合成

Chapter20蛋白质的生物合成

编码蛋白质的结构基因通过转录，将DNA上（基因上）的遗传信息传递给mRNA。mRNA上的核苷酸顺序直接决定蛋白质多肽链的氨基酸的顺序。本章讲授的主要内容:mRNA的核苷酸顺序是如何编码氨基酸顺序的呢？

蛋白质生物合成的机制是怎样的呢？一、遗传信息是如何编码氨基酸的？

遗传学实验证明，三个核苷酸代表一种氨基酸是一种正确的比例，因此每三个核苷酸即为一个氨基酸的一个遗传密码。采用突变试验可以证明:（同时增加三个或减少三个，可得到类似的结果）二、密码子是如何阐明的？1、用无细胞测活系统检验人工合成的或酶促合成的多核苷酸的表达情况●无细胞测活系统：●用单一核苷酸的聚合体，例如poly(U)、poly(A)等作为模板，检测氨基酸的入情况，证实UUU是Phe的密码子，AAA是Lys的密码子。（介绍检测实验如何操作）●多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）在密码子揭示中的作用2、用核糖体结合技术证实了各种密码子的组成和核苷酸的顺序1964年，Nirenberg发现：◆人工合成的三核苷酸可以起到mRNA模板的作用；◆在无GTP存在下，三核苷酸可以指导相应的氨酰-tRNA（即结合有某种氨基酸的tRNA）结合到核糖体上；◆硝酸纤维素膜能结合氨酰-tRNA而不结合游离的tRNA。

◆由于三核苷酸模板只与一定的tRNA进行密码子与反密码子识别，而tRNA又只能与一定

的氨基酸结合。因此，只要有带放射性标记的氨基酸被膜保留，即可测知模板是什么氨基酸的密码子(图)。利用上述方法(包括人工合成的有规定顺序的多核苷酸作模板)于1966年完整地阐明了编码20种氨基酸61种密码子，其他三种密码子UAG,UAA和UGA是蛋白质合成终止信号，即终止密码子三、密码子的性质1、密码子的简并性（degeneracy）：

★一种氨基酸由几种密码子编码的现象即称为简并。★编码一种氨基酸的几种密码子称为同义密码子（synonyms）。★只有Met和Trp分别只有一种密码子。★密码子的简并多数是第三位核苷酸有区别。例如His的密码子：CAU、CAC；Gln的密码子：CAA、CAG。

如果已知某多肽的氨基酸序列，根据氨基酸密码子的简并性，可推导该肽多种mRNA的序列（图）2、密码子几乎是通用的

密码子对胞液蛋白质合成系统来说是通用的，但在线粒体蛋白质合成系统中有些例外:

Codon(5'→3')胞液编码线粒体编码

AUAIle

MetAUGMetMetUGATerm

TrpUGGTrpTrpAGAArg

TermAGGArg

Term.3、密码子是不重叠的

密码子的不重叠和基因的重叠是不相同的（图）。基因的重叠是由于识读起点不同即阅读框不同所造成的（图）4、方向性5、起始信号是兼职的

在原核生物中，AUG和GUG具有双重功能，在作为蛋白质合成的起始密码子时，它们都编码甲酰-Met；如果出现在信使内部时，它们则分别编码Met和Val。在真核生物中，只有AUG兼有两者的功能，都编码Met。6、密码子无标点符号

Section2．蛋白质生物合成中的大分子一、mRNAmRNA是蛋白质合成的直接模板，蛋白质的氨基酸顺序由mRNA上三联体密码子的顺序决定。

在原核生物生物mRNA5’-端起始密码子前的前导顺序有一段富含嘌呤核苷酸顺序，能同16SrRNA3’-端的一段富含嘧啶的碱基顺序互补,这一特性可以将30S核糖体小亚基结合在邻近mRNA起始密码子的特定部位上。与蛋白质合成或起始合成有关。真核生物mRNA5'-端甲基化的“帽”结构可能也与蛋白质合成起始有关。二、tRNAtRNA是氨基酸的载体，以氨酰-tRNA的形式为蛋白质的合成提供氨基酸。它通过反密码子与密码子的相互作用，识别mRNA的信息，将其翻译成氨基酸。1、同功受体

能接受同一种氨基酸的多种tRNA叫做同功受体（isoacceptor）或同功转移RNA。例如：Val有三种tRNA可以与它结合。这可能与Val有四种密码子有关，因为其中三种可与三种相应的tRNA结合：RNA反密码子

密码子

氨基酸5'IGC3'5'GUU3'ValGACGUCValUACGUAValGUGVal2、tRAN反密码子的摆动性

摆动性是指一种氨基酸的tRNA上的反密码子可以同该氨基酸的几种密码子配对结合。例如：酵母丙氨酸的4种密码子

5'－GCU－3',

－GCC－－GCA－可以和酵母丙氨酸tRNA(tRNAAla)反密码子5’-IGC-3’配对。酵母tRNAArg的反密码子5’-ICG-3’能识别精氨酸3种密码子：5’-CGA-3’，5’-CGU-3’，5’-CGC-3’。

密码子与反密码子之间的配对关系反密码子的摆动性摆动学说认为，除了标准碱基配对外，还有非标准配对。摆动性一般出现在tRNA反密码子的第一位碱基和密码子的第三位碱基之间。摆动学说的碱基配对规律是(图)：

反密码子的

密码子的

第一位碱基

第三位碱基

AUCGGC或UUA或GIU或C或A三、氨酰-tRNA合成酶（氨基酸：tRNA连接酶）1、为什么氨基酸不能直接参入到蛋白质多肽链中？

★两个氨基酸借肽键结合是需要能量的，而自由的氨基酸本身是不活泼的。氨基酸本身对它专一的密码子是不能识别的。2、氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成氨酰-tRNA是氨基酸的激活形式，一种氨基酸只能与它的专一的tRNA结合。氨基酸与它的专一tRNA结合是由专一的氨酰-tRNA合成酶催化的，因此，细胞内至少存在20种不同的氨酰-tRNA合成酶（链接），在ATP供能的情况下氨酰-tRNA合成酶催化氨酰-tRNA的合成。

每种氨酰-tRNA合成酶都专一于一种氨基酸和其相应的一种或几种tRNA。E.coli所有氨酰-tRNA合成酶的结构都已测定，根据这些酶在一级结构和三级结构上的不同(链接)以及反应机制的差别（链接1）将其分为两类（链接2）。这两类酶在所有生物中都是相同的。a.E.coliglutamyl-tRNAsynthetase,aclassIenzyme;b.嗜热菌glyciyl-tRNAsynthetase,aclassIIenzyme.一级结构和三级结构上的不同C-2位连结C-3位连结反应机制的差别根据反应机制的差别将其分为两类,这两类酶在所有生物中都是相同的。一分子氨酰-tRNA的合成消耗两个高能磷酸键。氨酰-tRNA合成酶催化的反应分两步进行：氨基酸的活化(氨酰腺苷酸的形成)：氨基酸＋ATP＋E→氨基酸·AMP·E＋PPi

（当羧基被活化时往往形成酰基腺苷酸）氨酰-tRNA的生成：氨基酸·AMP·E＋tRNA→氨酰-tRNA＋AMP＋E焦磷酸的水解可以推动合成氨酰-tRNA（使反应变得不可逆）：

PPi＋H2O→2Pi△G0’=～﹣29.3kJ.mol-13、氨酰-tRNA合成酶具有校对功能例如：Val和Ile很相似，于是存在这样一种可能性，即把Val结合到tRNAIle上，并参入到Ile在肽链中的部位上。由于Ile-tRNA合成酶能进行校对，能阻止Val的渗入。因为Ile-tRNA合成酶能催化下面的反应：EIle·(Val·AMP)＋H2O→Val＋AMP＋EIle4、氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起着“第二套遗传密码子”的作用一种氨酰-tRNA合成酶必须对一种氨基酸和它的tRNA是高度专一的。这就要求一给定氨酰-tRNA合成酶既能识别给定的氨基酸，又能识别该氨基酸相应的tRNA。这种相互识别是非常重要的，因为这对于保证密码子的正确翻译和蛋白质合成的准确性是绝对必要的。在tRNA分子中，某些核苷酸是保守的，因而它们不可能被氨酰-tRNA合成酶用来甄别不同的tRNA。通过对能改变底物专一性的核苷酸变化研究，发现能被氨酰-tRNA合成酶用来甄别tRNA的核苷酸集中在氨基酸臂和反密码(包括反密码子本身)，有些位于tRNA的其他部位(图b)。图c是天冬氨酰-tRNA合成酶与被它识别的tRNA以及ATP所形成的复合物的X-射线晶体衍射图，该图显示氨基酸臂和反密码臂是相互识别的部位。这些研究结果显示氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起着“第二套遗传密码子”的作用。蓝色的点表示在所有tRNA中位置都是相同的核苷酸；桔红色或绿色是表示能被一种（桔红色）或多种（绿色）氨酰-tRNA合成酶识别的位点。结构特征而不是顺序对某些氨酰-tRNA合成酶的识别来说是重要的。该图显示氨基酸臂和反密码臂是相互识别的部位氨酰-tRNA合成酶和tRNA的相互作用起着“第二套遗传密码子”的作用四、核糖体核糖体是蛋白质合成的场所。核糖体是由rRNA和多种蛋白质组装成的一种结构复杂的大分子结合体。在核糖体的大亚基上有二个不同的部位：氨酰-tRNA接受部位(A部位)；肽基-tRNA结合部位（P部位）。核糖体的结构→多核糖体：在一条mRNA链上结合多个核糖体。每个核糖体都能单独执行合成一条同样的多肽链Section3原核生物蛋白质生物合成一、蛋白质合成的起始1、甲酰甲硫氨酰-tRNA的合成

E.coli和其他细菌合成蛋白质的起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸（fMet）。在E.coli细胞内存在两种可与Met结合的tRNA即tRNAfMet和tRNAmMet。两种tRNA各司其职。但两者的反密码子是相同的（CAU）。

★当Met与tRNAfMet结合后(即Met-tRNAfMet）可被甲酰化（图）生成fMet-tRNAfMet，可以作为蛋白质合成的起始物：

Met＋tRNAfMet＋ATP→Met-tRNAfMet＋ADP＋Pi

Met-tRNAfMet＋N10-甲酰四氢叶酸→fMet-tRNAfMet＋FH4★当Met与tRNAmMet结合后生成Met-tRNAmMet，不能被甲酰化，只能用于肽链的延长反应。甲酰基转移酶只能识别Met-tRNAfMet，而不能识别Met-tRNAmMet。

●什么因素能保证fMet-tRNAfMet只能识别起始密码子AUG,而不能识别信使内的AUG（Met的密码子）呢？2、起始复合物的形成1)30S起始复合物的形成在E.coli中，业已证明起始因子参与了30S起始复合物的形成。这些因子是IF-1、IF-2和IF-3。

2)70S起始复合物的形成30S起始复合物的形成创造了与50S核糖体大亚基结合的条件，可以同50S亚基结合形成70S起始复合物。当50S同30S起始复合物结合时，伴随着GTP的水解，同时释放出IF-3、IF-1和IF-2。这样fMet-tRNAfMet就占据着核糖体的P部位。在70S起始复合物形成时，IF-2起着水解GTP的作用，并使30S起始复合物的构象发生变化，导致了IF-3、IF-1和IF-2的释放。二．肽链的延伸（Elongation）70S起始复合物形成之后，便可发生肽链延伸（Elongation）的循环反应（图）。该循环反应包括三个步骤：■氨酰基-tRNA进入到核糖体的A部位；■肽键的形成；■移位反应（translocation）。

延长反应需要三种蛋白质因子参与。这些延长因子（Elongationfactors）是：EF-Tu、EF-Ts和EF-G。三、肽链合成的终止遗传学和生物化学研究表明，在mRNA上存在三种终止密码子：UAG、UAA、UGA。终止密码子的识别需要特殊的终止因子或释放因子。在原核生物中，分离到三种与肽链合成终止有关的释放因子(Releasingfactors)：RF-1、RF-2、RF-3。RF-1能识别终止密码子UAA和UAG；RF-2能识别终止密码子UAA和UGA；

RF-3是一种GTP结合蛋白，本身对终止密码子没有识别能力，但它在与GTP结合后能促进RF-1和RF-2同核糖体结合的能力。当终止密码子出现在核糖体A部位相对应的地方时，完整的多肽已经移位到P部位。此时终止过程便开始了(图)。在GTP的存在下，释放因子识别终止密码子，并结合到A部位，诱导肽基转移酶的活性改变，使其具有水解酶活性(或者说这个酶能催化肽基转移到水分子上而发生水解反应)。这样即可水解肽链和tRNA之间的酯键，从而释放出完整的肽链。然后，释放因子在GTP水解的情况下从核糖体上释放出来(RF具有依赖于核糖体的GTPase的活性)，tRNA和mRNA从核糖体上也释放出来。核糖体的大小两个亚基随之解离，并可重新装配成70S起始复合物。mRNA很不稳定，很快就会被降解。四、新合成的多肽链经受折叠和加工新生的多肽链需要折叠和加工才能成为生物学上活泼的分子。在合成时或合成后，多肽通过侧链疏水相互作用以及合适的氢键、离子键、范德华力的形成、折叠成它的天然构象，mRNA一维的遗传信息转变成蛋白质的三维结构。蛋白质合成后的加工或修饰(posttranslationalmodifications)包括：①氨基末端和羧基末端的修饰；②信号顺序的切除；③个别氨基酸的修饰；④糖基化；⑤辅基的加入；⑥肽链的局部水解；⑦二硫键的形成等。四、蛋白质合成过程中的能量问题蛋白质生物合成是一个耗能过程，需要消耗ATP和GTP。☆ATP主要用于氨基酸的活化(生成氨酰-tRNA)。☆GTP的主要作用不是为生物合成提供能量。

●从蛋白质合成的全过程看，第一个肽键的形成至少需要消耗7个高能键：▲fMet-tRNAfMet的形成，消耗1分子ATP，即两个高能键；▲第二个氨酰-tRNA的形成；消耗1分子ATP，即两个高能键；

▲70S起始复合物的形成，消耗1分子的GTP；▲氨酰-tRNA进入A部位，EF-Tu的释放，消耗1分子的GTP；▲移位反应消耗1分子的GTP●以后的肽链延长反应，每参入一个氨基酸，消耗4个高能键。最后肽链合成的终止反应消耗1分子GTP。例如：合成由200氨基酸残基构成的蛋白质，总共要消耗(7+198×4+1）=800的高能键。因此，蛋白质的合成是一个高度耗能的过程。五、GTP在蛋白质合成中的作用实验表明，GTP的水解与蛋白质合成中所涉及的蛋白质因子的构象改变有关，使这些因子循环结合到核糖体上和从核糖体上解离下来。当以GTP的类似物鸟苷酰亚胺二磷酸(GDPNP)(图)代替GTP同EF-Tu结合，EF-Tu·GDPNP复合物携带氨酰-tRNA进入到核糖体上后，EF-Tu·GDPNP不能从核糖体上解离下来，因为EF-Tu·GDPNP不能被水解。GTP水解的目的是为了改变EF-Tu的构象，以便它从核糖体解离下来。而且还有实验表明，当GTP同EF-Tu结合后能增高EF-Tu同氨酰-tRNA以及同核糖体的亲和力。当GDP同EF-Tu结合时，它既不能与核糖体结合，也不能与氨酰-tRNA结合。

★23SrRNA几乎可以肯定参与肽键形成的反应，这是因为：●有证据表明RNA能作为催化剂；●RNA是核糖体的主要组分；●核糖体RNA在进化过程中比核糖体蛋白更具高度的保守性；●任何一种核糖体蛋白的缺失并不导致核糖体功能的消失；●能抑制蛋白质合成的抗菌素的抗性突变株是由编码rRNA的基因而不是编码核糖体蛋白的基因的突变所致。●HarryNoller的实验表明，来自适温细菌的50S亚基，除去它的95%的蛋白质后，但保留它的完整的RNA，它的活性仍保留80%以上。★无义抑制因子阻止翻译提前终止：能将某种氨基酸的密码子（“有义”密码子）转变成终止密码子的突变叫做无义突变(nonsensemutation)。这种突变会导致翻译提前终止(prematureterminationoftranslation)。具有这种突变的生物可以通过某种tRNA基因的突变而得到“挽救”，这种突变的tRNA能识别无义密码子(nonsensecodon)，因此称之为无义抑制因子tRNA。这种无义抑制因子tRNA象它的野生型祖先一样携带同一种氨基酸，并在终止密码上把该氨基酸添加到正在生长着的肽链上，从而阻止肽链合成的终止。

例如：E.coli琥珀抑制因子(ambersuppressor，叫SU3)是一种tRNATyr，它的反密码子已从野生型的GUA（它们识读Tyr的密码子UAU和UAC）突变成CUA（它可以识别琥珀终止密码子UAG）。一种叫做SU3＋的E.coli细胞，在一种编码必需蛋白质的基因上具有致死的琥珀突变，如果Tyr代替原有野生型（正常的）氨基酸参入到该蛋白质中而又不致使其失去活性的话，那么这个突变株是可以成活的。为什么细胞能耐受这样的突变呢？因为突变的tRNA通常是同工受体的次要成员，而且能与释放因子竞争终止密码子。因此抑制因子挽救的突变体比正常的野生型细胞生长缓慢。

六、真核生物蛋白质合成的有关问题真核生物蛋白质的合成虽然比原核生物蛋白质合成要复杂得多，但基本过程是相同的。两类生物的蛋白质合成的主要差别表现在合成的起始阶段。◆真核生物蛋白质合成的起始氨基酸是Met而不是fMet；起始tRNA是tRNAiMet而不是tRNAfMet；起始密码子只有AUG。◆在真核生物中，已知涉及九种蛋白质因子参与蛋白质合成的起始(表)。真核生物蛋白质合成起始因子用eIF表示。eIF-2由三个亚基组成：α亚基参与GTP的结合；β亚基与Met-tRNAiMet结合有关；γ-亚基的功能尚不清楚。

①首先，eIF-2在GTP的存在下，将Met-tR