硕士论文开题报告-

牦牛初乳中抗菌作用相关基因的克隆与表达

学科专业：指导教师：报告人：1开题内容一、研究意义和国内外现状二、主要研究内容三、研究方法四、技术路线五、论文特色和创新点六、年度方案七、经费预算21、工程的研究意义与国内外研究现

状述评哺乳动物初乳中含有大量的生物活性物质，包括多种免疫球蛋白、非抗体保护蛋白、酪蛋白源生物活性肽等。其中溶菌酶〔Lysozyme〕、转铁蛋白〔Transferrin,Tf〕等蛋白质具有明显的抗菌活性，并且是新生动物必需的营养调节物质。从牦牛幼畜疾病控制的角度考虑，在饲料中添加乳源的抗菌物质可能成为控制养殖环节中幼犊死亡的关键技术之一。目前，已成功将人乳腺中的Lysozyme基因转入水稻，并将转基因水稻生产的米粉作为防止婴儿腹泻的营养食品。因此，通过日粮添加基因工程方法生产的Lysozyme、Tf可望解决牦牛幼犊腹泻导致死亡的问题。32、本课题研究的主要思想，主要观

点，主要内容，重点和难点分析

2.1研究的主要思想观点和目标：克隆牦牛乳腺中的Lysozme和Tf全基因和其cDNA序列；获得转Lysozme和Tf基因的E.coli基因工程菌；获得转Lysozme和Tf基因的酵母基因工程菌。亲和层析法别离重组的Lysozme和Tf并进行抗菌和犊牦牛的饲养实验。42.2研究的主要内容2.2.1Lysozme、Tf基因克隆①根据黄牛的Lysozme、Tf基因cDNA序列设计PCR引物②牦牛Lysozme、Tf基因的克隆和全长cDNA的获得和鉴定2.2.2Lysozme和Tf在E.coli中的异源表达2.2.3Lysozme和Tf在酵母中的异源表达52.2.4Lysozme、LFc和Tf重组蛋白的别离纯化①采用亲合层析法从基因工程菌中别离纯化Lysozme和Tf②表达产物的别离纯化及抗菌机理研究2.2.5Lysozme、Tf对犊牦牛的营养作用机理研究①Lysozme、Tf对犊牦牛肠道形态学及微生物菌群的影响②Lysozme、Tf和对犊牦牛生长性能及免疫指标的影响62.3拟解决的关键问题:本工程中存在三个关键的技术问题①全长cDNA的获得由于普通牛的Lysozme、Tf基因已经被克隆,因此可采用PCR或RT-PCR的方法获得2个基因的cDNA序列或全基因序列。为获得全长cDNA序列我们准备采用Clontech公司的SmartcDNA合成技术得到全长cDNA。其特点是采用了一种名为superscriptⅡ的逆转录酶。7②高效异源表达系统载体的构建由于Lysozme、Tf均为真核生物的基因，其蛋白上有许多修饰基团，因此在表达该蛋白时采用真核表达系统是适宜的。解决问题的方法是除用大肠杆菌的pET载体进行表达外，还将Lysozme、Tf基因在酵母用pPICZαA载体载体进行表达。8③异源表达的Lysozme和Tf抑菌和抗菌效果异源表达的Lysozme和Tf是否具有抑菌和抗菌效果是本工程的关键之一，因此当表达产物的抑菌和抗菌活性较低或不具有抑菌和抗菌效果时，可更换不同的表达系统。93、研究方法3.1乳腺组织总DNA和mRNA的制备：采用常规方法进行。全长cDNA的合成用Clontech公司的SMART技术合成。Lysozme、Tf基因序列的获得采用PCR方法，相应基因的cDNA序列通过RT-PCR方法获得。3.2Lysozme和Tf的cDNA采用pET-32载体构建失控型载体在E.coli进行原核表达。103.3Lysozme、Tf的cDNA采用毕赤酵母的pPICZαA载体进行表达。3.4Lysozme和Tf的抗菌和饲养实验按按常规方法进行。4技术线路和实验方案4.1总技术路线11采样牦牛

12初乳期乳腺组织常乳期乳腺组织

别离mRNA别离mRNA

全长cDNA的获得全长cDNA的获得

RT-PCR克隆牦牛Lysozme和Tf的cDNA

与T载体的连接

序列测定

与E.colipET载体的连接与YeastpPICZαA载体的连接

基因工程重组菌的筛选基因工程重组菌的筛选

异源表达蛋白的别离纯化异源表达蛋白的别离化

Lysozme、Tf抗菌机理的研究犊牦牛饲养效果研究

大肠杆菌沙门氏菌痢疾杆菌免疫指标肠道形态学及微生物菌群134.2Lysozme和Tf的cDNA在大肠杆

菌中的表达cDNA的合成重组载体的构建转化大肠杆菌阳性克隆的别离鉴定基因工程菌的发酵与培养重组蛋白的别离与纯化重组蛋白与天然蛋白的抗菌抑菌试验14TFBamH1BamH1Xho1Xho1连接酶154.3Lysozme、Tf的cDNA在酵母菌

中的表达

Lysozme、Tf全基因的合成〔引入酶切位点〕酶切酶切

连接转化鉴定阳性克隆、测序电转化酵母鉴定阳性克隆感受态细胞抗菌实验蛋白纯化SDSWestern-blot摇瓶发酵培养及定量165本工程的特色与创新之处首次通过分子生物学方法克隆牦牛Lysozme、Tf基因。首次构建牦牛Lysozme和Tf基因的大肠杆菌基因工程菌。研究重组蛋白对大肠杆菌、沙门氏菌等的抗菌效果。通过在日粮中添加重组Lysozme和Tf蛋白研究其抗菌效果，并研究其对犊牦牛的营养机理。对重组的Lysozme和Tf添加到犊牦牛日粮的可行性进行研究，探讨通过现代生物技术提高犊牦牛生长潜力的可能性。本工程如获成功，可能具有较大的应用价值。176年度方案2007年

1、选题和资料收集

2、文献整理、阅读以及实验方案的设计

3、采样、提取RNA、合成cDNA182021年1、完成Lysozme、Tf基因在大肠杆菌和酵母菌中的表达。2、完成Lysozme、Tf重组蛋白对奶犊牦牛的营养抗菌机制研究。2021年6月前整理研究结果,撰写毕业论文，论文辩论197经费预算：〔万元〕