基因工程的理论基础与基本技术

基因工程的理论基础与基本技术第一页，共一百七十页，2022年，8月28日1、有毒试剂基因工程实验安全溴化乙锭（EB）：

DEPC(焦碳酸二乙酯):强有力的蛋白质变性剂丙烯酰胺：有毒，影响中枢神经系统

过硫酸酸铵：对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤有较大危害性，吸入可致命。

第二页，共一百七十页，2022年，8月28日2、紫外线紫外分析仪紫外灭菌3、放射线放射性同位素氯化铯：（重金属）可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。

甲醛：毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂酚、氯仿：蛋白质变性剂4、转基因生物5、水电安全第三页，共一百七十页，2022年，8月28日需注意防止污染1、微生物污染2、DNA、RNA污染3、其他污染第四页，共一百七十页，2022年，8月28日仪器的正确操作微量移液器离心机灭菌锅蒸馏水器电子天平第五页，共一百七十页，2022年，8月28日由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。一

DNA的提取与纯化第六页，共一百七十页，2022年，8月28日（一）、质粒DNA的提取第七页，共一百七十页，2022年，8月28日plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNA第八页，共一百七十页，2022年，8月28日闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性第九页，共一百七十页，2022年，8月28日染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性第十页，共一百七十页，2022年，8月28日（2）

所用的试剂作用①

溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。第十一页，共一百七十页，2022年，8月28日③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。第十二页，共一百七十页，2022年，8月28日冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA用于沉淀DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液第十三页，共一百七十页，2022年，8月28日⑦RNaseA降解RNA。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。第十四页，共一百七十页，2022年，8月28日蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨

酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。第十五页，共一百七十页，2022年，8月28日（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA第十六页，共一百七十页，2022年，8月28日溶液II

破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第十七页，共一百七十页，2022年，8月28日最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。第十八页，共一百七十页，2022年，8月28日这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。第十九页，共一百七十页，2022年，8月28日若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12第二十页，共一百七十页，2022年，8月28日（二）、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备大肠杆菌基因组DNA第二十一页，共一百七十页，2022年，8月28日

一般过程及原理：

（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37℃温育。不用NaOH!第二十二页，共一百七十页，2022年，8月28日（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。苯酚2次酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶11次氯仿∶异戊醇24∶11次第二十三页，共一百七十页，2022年，8月28日

一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。

组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提第二十四页，共一百七十页，2022年，8月28日0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50℃温育。（2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。也是蛋白质变性剂。苯酚2次酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶11次氯仿∶异戊醇24∶11次第二十五页，共一百七十页，2022年，8月28日（5）除去RNA污染用RNase。用2倍体积的无水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）第二十六页，共一百七十页，2022年，8月28日

一般过程及原理：

（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。3.从植物组织中制备

DNA（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。

65℃温育。第二十七页，共一百七十页，2022年，8月28日CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。

巯基乙醇作为还原剂使多酚氧化酶失活，可以防止酚类的氧化。第二十八页，共一百七十页，2022年，8月28日用0.6倍体积的异丙醇（-20℃）。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）。第二十九页，共一百七十页，2022年，8月28日（三）、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法DNA（或

RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。原理：蛋白质在280nm处有吸收峰第三十页，共一百七十页，2022年，8月28日2第三十一页，共一百七十页，2022年，8月28日浓度测定步骤一、用无菌TE或双蒸水将待测样品稀释20倍或更高。二、用无菌TE或双蒸水做对照，将紫外分光光度计260nm、280nm、310nm调到零点。三、加入DNA稀释液在260nm、280nm、310nm测定OD值。四、计算DNA浓度ssDNA：[ssDNA]=33×（OD260—OD310）×稀释倍数dsDNA：[dsDNA]=50×（OD260—OD310）×稀释倍数ssRNA：[ssRNA]=40×（OD260—OD310）×稀释倍数第三十二页，共一百七十页，2022年，8月28日衡量提取DNA的纯度OD260/OD280＞1.8可能有RNA污染OD260/OD280＜1.8可能有蛋白质污染再进行酶消化处理，酚氯仿抽提去酶第三十三页，共一百七十页，2022年，8月28日溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发

红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。第三十四页，共一百七十页，2022年，8月28日一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。（四）、DNA分子量的估计MarkerMarker第三十五页，共一百七十页，2022年，8月28日DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker第三十六页，共一百七十页，2022年，8月28日

自从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶被引进核酸研究以来，凝胶电泳已经发展成为一种分析重组DNA分子的重要技术手段，同时也被广泛地应用于DNA的核酸内切酶消化片段的分析、分离和纯化以及蛋白质的分析和纯化等方面的工作。二凝胶电泳技术第三十七页，共一百七十页，2022年，8月28日1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

（一）、电泳的基本原理第三十八页，共一百七十页，2022年，8月28日4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5.第三十九页，共一百七十页，2022年，8月28日Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。第四十页，共一百七十页，2022年，8月28日超螺旋线性开环第四十一页，共一百七十页，2022年，8月28日第四十二页，共一百七十页，2022年，8月28日第四十三页，共一百七十页，2022年，8月28日（二）、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。

浓度高空隙小第四十四页，共一百七十页，2022年，8月28日琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。第四十五页，共一百七十页，2022年，8月28日带电颗粒在电场作用下移动的速度叫做电泳迁移率。（1）DNA分子的大小。（2）DNA的构象。（3）琼脂糖浓度。（4）溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。（5）电压。（6）电泳缓冲液的成分及浓度。何为电泳迁移率？影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些？第四十六页，共一百七十页，2022年，8月28日优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1（三）

、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：分离300—50000bp聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离1—1000bp第四十七页，共一百七十页，2022年，8月28日第四十八页，共一百七十页，2022年，8月28日（四）、凝胶染色1.染料溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）第四十九页，共一百七十页，2022年，8月28日EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。2.原理第五十页，共一百七十页，2022年，8月28日第五十一页，共一百七十页，2022年，8月28日

第五十二页，共一百七十页，2022年，8月28日第五十三页，共一百七十页，2022年，8月28日UVP全自动凝胶成像分析系统第五十四页，共一百七十页，2022年，8月28日OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统第五十五页，共一百七十页，2022年，8月28日（五）、聚丙烯酰胺凝胶银盐染色法银盐染色法灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。

第五十六页，共一百七十页，2022年，8月28日具体步骤1、固定液固定：2.5ml95%乙醇、2.5ml冰醋酸定容到500ml2、染色液染色：1克硝酸银定容至500ml3、显色液显色：7.5克NaOH加5.4ml甲醛定容至500ml第五十七页，共一百七十页，2022年，8月28日DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。三

核酸的分子杂交

第五十八页，共一百七十页，2022年，8月28日（一）、Southernblot用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。第五十九页，共一百七十页，2022年，8月28日第六十页，共一百七十页，2022年，8月28日第六十一页，共一百七十页，2022年，8月28日Southernblot筛选结果第六十二页，共一百七十页，2022年，8月28日（二）、Northernblot用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。第六十三页，共一百七十页，2022年，8月28日（三)、

原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。需要目的基因的探针。第六十四页，共一百七十页，2022年，8月28日第六十五页，共一百七十页，2022年，8月28日四

基因扩增技术---PCR(一)、基因扩增（geneamplification)指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：1.环境诱发扩增2.基因的程序性扩增5.PCR扩增3.基因组进化扩增4.基因工程扩增第六十六页，共一百七十页，2022年，8月28日1.环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。2.基因的程序性扩增如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。第六十七页，共一百七十页，2022年，8月28日生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。3.基因组进化扩增4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。第六十八页，共一百七十页，2022年，8月28日（1）1.PCR的发明(二)、PCR技术1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA片段。

第六十九页，共一百七十页，2022年，8月28日（2）Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。第七十页，共一百七十页，2022年，8月28日（3）TaqDNA聚合酶1988年

R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使

PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年

Cetus公司发明自动热循环仪。1986年

H.A.Erilish从嗜热

水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段（37℃)，PCR技术才进入实用阶段。第七十一页，共一百七十页，2022年，8月28日第七十二页，共一百七十页，2022年，8月28日PCR仪第七十三页，共一百七十页，2022年，8月28日2.PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸第七十四页，共一百七十页，2022年，8月28日双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95℃（1）DNA模板变性模板模板（template）95℃第七十五页，共一百七十页，2022年，8月28日TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）:40-65℃第七十六页，共一百七十页，2022年，8月28日DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72℃第七十七页，共一百七十页，2022年，8月28日理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（5）1个循环的结果（4）新一轮循环开始第七十八页，共一百七十页，2022年，8月28日3.PCR的过程（1）第一步预变性（denature）94-95℃下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步

循环（circle）94℃下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。①变性（denature）第七十九页，共一百七十页，2022年，8月28日72℃下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3’端上加上核苷酸。③

延伸（extend）②复性（anneal）50-60℃下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高②引物的链短。（3）第三步

补齐（fill）72℃下10分钟，TaqDNA聚合酶在非全长片段的3’端上加上核苷酸使之成为全长片段。第八十页，共一百七十页，2022年，8月28日第二步——第三步——第四步复性延伸变性95℃5min50℃1min72℃2min94℃1min温度循环72℃10min第八十一页，共一百七十页，2022年，8月28日PCR仪的温度循环程序第八十二页，共一百七十页，2022年，8月28日第八十三页，共一百七十页，2022年，8月28日需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强

①PCR使用专门合成的DNA引物。②延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高

这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！第八十四页，共一百七十页，2022年，8月28日RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA（4）简便

先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（3）快速

整个PCR过程约4小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。第八十五页，共一百七十页，2022年，8月28日自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37℃)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶

5.影响

PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①

热稳定性第八十六页，共一百七十页，2022年，8月28日最适温度：

75-80℃

延伸速度：

约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb②

最适温度高③Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3’

5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！

合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。第八十七页，共一百七十页，2022年，8月28日金属离子敏感（尤其是Mg2+

）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。第八十八页，共一百七十页，2022年，8月28日（2）其它耐热的

DNA聚合酶

①TthDNA聚合酶无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100℃高温。第八十九页，共一百七十页，2022年，8月28日③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR产物为平端！

是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。第九十页，共一百七十页，2022年，8月28日与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（

5’端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’

3’

第九十一页，共一百七十页，2022年，8月28日即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15—30bp。第九十二页，共一百七十页，2022年，8月28日③引物的碱基序列

5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer第九十三页，共一百七十页，2022年，8月28日尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右。④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T发卡结构1）2）第九十四页，共一百七十页，2022年，8月28日3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer第九十五页，共一百七十页，2022年，8月28日4）引物3`端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸;

5）为了便于后续的克隆可以在5`端加保护碱基和酶切位点。第九十六页，共一百七十页，2022年，8月28日⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55℃。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5℃。手工计算：一般估计：第九十七页，共一百七十页，2022年，8月28日⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.5mol/L。⑦简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。第九十八页，共一百七十页，2022年，8月28日设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等第九十九页，共一百七十页，2022年，8月28日Primer5.0第一百页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零一页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零二页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零三页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零四页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零五页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零六页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零七页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零八页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百零九页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百一十页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百一十一页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百一十二页，共一百七十页，2022年，8月28日但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②

模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①

纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。第一百一十三页，共一百七十页，2022年，8月28日

dNTPs是

dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。（5）dNTPs一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。第一百一十四页，共一百七十页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+

。（6）Mg2+

的浓度

所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用的MgCl2终浓度。第一百一十五页，共一百七十页，2022年，8月28日标准的PCR反应体系1、引物各0.1umol2、4种dNTP各200umol/L3、10×buffer10ul2.5ul4、模板DNA

0.1～2ug0.025～0.5ug5、Taq酶2.5u0.625u6、Mg2+1.5mmol/L7、ddH2O加至100ul加至25ul100ul25ul第一百一十六页，共一百七十页，2022年，8月28日6.PCR技术的延伸技术（1）荧光实时定量PCR常规PCR电泳鉴定产物的量缺憾1无法对初始模板精确定量2无法实时监测扩增情况3跑胶繁琐、易污染第一百一十七页，共一百七十页，2022年，8月28日借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。

Real—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：样品到达阈值水平所经历的循环数。

第一百一十八页，共一百七十页，2022年，8月28日ThresholdlineC(t)value

阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准。

C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数。第一百一十九页，共一百七十页，2022年，8月28日荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210

设定标准品，绘制标准曲线通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量unknown104103Ct值模板量到达阈值的循环数阈值第一百二十页，共一百七十页，2022年，8月28日扩增两个引物外侧的未知序列（2）反向PCR把线性DNA模板转变成环形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：第一百二十一页，共一百七十页，2022年，8月28日使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。第一百二十二页，共一百七十页，2022年，8月28日低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。（3）不对称PCR3’

5’

5’

3’

引物少用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。第一百二十三页，共一百七十页，2022年，8月28日扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反转录PCR（RT-PCR)Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。第一百二十四页，共一百七十页，2022年，8月28日RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶第一百二十五页，共一百七十页，2022年，8月28日(5)巢式PCR（Nest-PCR）巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。P1P3P4P2第一百二十六页，共一百七十页，2022年，8月28日（6）原位PCR(in-situPCR)原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术，就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。

第一百二十七页，共一百七十页，2022年，8月28日（7）锚定PCR（anchoredPCR）锚定PCR：扩增已知序列侧翼未知序列的一种PCR方法，未知的3’端添加一同聚物尾（polyG)，以互补的同聚物引物（polyC)和按已知序列设计的引物一起作PCR扩增。关键：利用末端转移酶在未知一端创造引物结合位点第一百二十八页，共一百七十页，2022年，8月28日已知序列末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC未知序列5’3’第一百二十九页，共一百七十页，2022年，8月28日7.PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；第一百三十页，共一百七十页，2022年，8月28日在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变

技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。第一百三十一页，共一百七十页，2022年，8月28日设计引物定点诱变第一百三十二页，共一百七十页，2022年，8月28日利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。（3）基因组的比较研究

比较不同物种之间的基因组特征和相似性。限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)第一百三十三页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百三十四页，共一百七十页，2022年，8月28日1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：当时没有能把不同长度的核苷酸片段分离开的技术。当时的分析思路局限于RNA序列分析法。五

DNA序列分析（1965年Cornell大学的S.W.Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片段法）。第一百三十五页，共一百七十页，2022年，8月28日Sanger等1977年发明。(一)、双脱氧链终止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化学奖第一百三十六页，共一百七十页，2022年，8月28日（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配

对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终

止。1.原理

第一百三十七页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百三十八页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百三十九页，共一百七十页，2022年，8月28日（1）制备单链DNA模板2.技术要点

就是待测序的

DNA链。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。

（2）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP时,DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。第一百四十页，共一百七十页，2022年，8月28日需带有放射性或荧光标记。（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）第一百四十一页，共一百七十页，2022年，8月28日3.Sanger双脱氧终止法测序过程第一百四十二页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百四十三页，共一百七十页，2022年，8月28日模板序列第一百四十四页，共一百七十页，2022年，8月28日1977年，哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明。(二)、Maxam-Gilbert化学修饰法WalterGilbert,1980年NobelPrize化学奖第一百四十五页，共一百七十页，2022年，8月28日末端放射性标记的DNA片单链长度只差一个核苷酸的DNA链混合物化学试剂处理凝胶电泳放射性自显影阅读碱基顺序特定的碱基中引入化学基团DNA在被修饰的核苷酸位置断裂1.原理

第一百四十六页，共一百七十页，2022年，8月28日碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲脂对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶2.碱基特异的化学修饰法

第一百四十七页，共一百七十页，2022年，8月28日反应切割碱基修饰修饰碱基的转移DNA链的断裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加热氢氧化钠R2A>G硫酸二甲脂酸氢氧化钠R3C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R4C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R5G硫酸二甲脂六氢吡啶六氢吡啶R6G+A酸酸六氢吡啶R7C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R8C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R9A>C氢氧化钠六氢吡啶六氢吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加热六氢吡啶R11G亚甲蓝六氢吡啶六氢吡啶R12T四氧化锇六氢吡啶六氢吡啶3.碱基特异的化学切割法

第一百四十八页，共一百七十页，2022年，8月28日4.测序过程

第一百四十九页，共一百七十页，2022年，8月28日每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。特点：读出的序列就是要测的序列。Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。第一百五十页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百五十一页，共一百七十页，2022年，8月28日第一百五十二页，共一百七十页，2022年，8月28日测序读片第一百五十三页