QIAGEN DNA甲基化试剂盒说明中文版

QIAGENEpiTect®Bisulfite二IBisulfitereactionDNAandEpiTectreactionbuffersWashDesulfonationWash(x2)LoadSpinColumnAddBufferBWAddBufferBDAddBufferBWDNAconversioninthermalcycler(5h)Transferto1.5mlmicrotubeAddBufferBLEpiTectBisulfiteConversionProcedure二IBisulfitereactionDNAandEpiTectreactionbuffersWashDesulfonationWash(x2)LoadSpinColumnAddBufferBWAddBufferBDAddBufferBWDNAconversioninthermalcycler(5h)Transferto1.5mlmicrotubeAddBufferBLEpiTectBisulfiteConversionProcedure•重亚硫酸盐处理DNA时，需要经高盐浓度、高温和低PH条件，会导致DNA断裂和片段化，并在随后的纯化过程中丢失，所以需要大量的inputDNA•重亚硫酸盐转化未甲基化的胞嘧啶，转化率超过99%•BisulfiteMix足够做8个反应，用时要将BisulfiteMix溶于800山RNase-freewater中，溶解的BisulfiteMix在-20°C可以保存4周DNAProtectBuffer能保护重亚硫酸盐处理的DNA在高温、低ph条件下被片段化CarrierRNA能提高小量DNA（小于500pg，体积大于40山）绑定在回收柱滤膜上的效率，帮助核酸沉淀；总量大于100ng的基因组DNA没有必要加CarrierRNAEpiTectBisulfiteKit在-20C可以保存3年；可以适用于大范围的DNA量，inputDNA范围为1ng~2yg；模板DNA片段范围可以在500bp~30kb之间ProtocolDNA量在1ng~2pg之间，体积20山以上开始前的准备重点：BisulfiteMix足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的BisulfiteMix保存于-20°C,4周内并不会影响其性能DNAProtectBuffer在加入DNA-BisulfiteMix后会由绿变蓝（step2）,表明溶液混合很充分且PH值正确所有的离心分离步骤均在室温（15-25°C）下完成开始前准备的东西：加入30ml乙醇（96%~100%）到BufferBW中，室温（15-25°C）保存，使用之前摇匀加入27ml乙醇（96%~100%）到BufferBD中，2~8C保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响BufferBD的性能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。加入310山RNase-freewater到冻干的carrierRNA（310|ig）中，配成1愿/山的溶液。当一次处理48个样本，将溶解的carrierRNA加入到BufferBL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。如果处理的样本较少，则将溶解的carrierRNA分装，并储存于-20C,分装的carrierRNA能保存1年。如果少于48个样本要在2周之内完成处理，则参照表1的体积比取一定体积的BufferBL与carrierRNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrierRNA。如果BufferBL有沉淀，则需加热（最高不超过70C）并温和搅拌使其溶解。表1BufferBL与carrierRNA的体积比Numberofsamples]48162448VolumeofBufferBL*620jul2.5ml5ml10ml15ml31mlVolumeof6.2fj\25创50灿100/ul150pl310glcarrierRNAsolution^*Thevolumesgivencontain□1D%surplusforpipettinginaccuracies.1Resultinginafinalconcenirationof10pg/mlcarrierRNAinBufferBL.・室温平衡样本和Buffers实验流程重亚硫酸盐转化DNA融化DNA备用，溶解BisulfiteMix,加入800山RNase-freewater,混匀5min使其完全溶解。如有必要，60°C加热并混匀BisulfiteMix-RNase-freewater溶液使其溶解。注意不要将溶解的BisulfiteMix置于冰上。在200山离心管中配制重亚硫酸盐转化反应液，参照表2配制反应体系，DNA体积不足20山则用RNase-freewater补足。（处理低浓度DNA（1~500ng或小于500pg）时，DNA体积增加到40山，DNAProtectBuffer减少为15山，总体积140山不变）表2重亚硫酸盐转化反应体系ComponentVolumeperreaction(pl)DNAsolution(1ng-2//g)Variable*(maximum70戏1]RNase-freewaterVariable*BisulfiteMix(dissolved),seestep185DNAProtectBuffer35Totalvolume140AIhecombinedvolumeotDNAsolutionandRNase-freewatermusttDtal20pl.3.盖上PCR管盖，混匀反应液，置于室温(15-25°C)°DNAProtectBuffer在加入DNA-BisulfiteMix后会由绿变蓝，表明混匀充分且PH值正确。4.在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应条件参照表3。整个反应过程需要5h。表3重亚硫酸盐转化反应条件StepTimeTemperatureDenaturation5min95°CIncubation25rriin60°CDenaturation5min95^Incubaiion85min(1h25min)609Denaturation5min95&Clncubai?on175min(2h55min)HoldIndefinite^20"CTConvertedDNAcanbeleftinihethermalcyclerovernightwithoutarylossofperformance.5.将PCR管放入循环加热器中，开始转化反应。注意PCR管中不要加入矿物油，保证管盖密封。已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。纯化重亚硫酸盐转化的DNA待转化反应完成之后，取出PCR管，瞬时离心，再将PCR管中的反应液转到一个1.5ml的干净的离心管中。转移反应液不影响其性能。在每个样本中加入560山现配的BufferBL（参照表1加入10yg/mlcarrierRNA），涡流混匀并瞬时离心。如果DNA大于100ng,则不需要加入carrierRNA。（处理FFPE样本或DNA量小于500pg的样本时，加入现配的BufferBL的体积减少为310山（加入10yg/mlcarrierRNA），混匀离心，之后再加入250山96T00%乙醇，混匀15s后瞬时离心）将收集管和回收柱按样本编号并放置在架子上，将1.5ml离心管中的样本混合液全部转移到相应的回收柱内。以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。在每个回收柱内加入500山BufferBW（washbuffer），用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。在每个回收柱内加入500山BufferBD（desulfonationbuffer，脱磺酸基），盖上回收柱盖子，室温（15-25°C）放置15min。如果BufferBD中有沉淀，避免将沉淀加到回收柱内。装有BufferBD的瓶子在使用后要立即盖上盖子，避免接触的空气中的CO2发生酸化。以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。在每个回收柱内加入500^lBufferBW，用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。重复步骤13一次。将回收柱放到一个新的2ml收集管中，以离心机最大转速离心1min，移除所有的残余液体。（推荐）将回收柱放到一个干净的1.5ml离心管中，56°C加热5min，使残余的液体完全蒸发。再将回收柱转移