实验SDS-PAGE蛋白电泳

蛋白质的分离聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳法一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术二.基本原理(一)电泳电泳:带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象.(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳

用丙烯酰胺(Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质.以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。1凝胶聚合催化体系化学催化：AP-TEMED催化体系Bis将单体长链间连成网状结构

化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：•

催化剂和加速剂的浓度•pH碱性条件•

温度•

分子氧•

杂质

2.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1)凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好；(2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。(3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系3.凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关

4.聚丙烯酰胺凝胶种类(1)连续系统与不连续系统两大类

不连续系统:是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。

(2)不连续体系:电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。三.实验器材1、电泳仪,电泳槽及其附件2、培养皿3、摇床4、烧杯5、移液管6、微量进样器7、针管电泳装置电泳仪：提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移垂直平板电泳槽每组（3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。四.实验试剂BSA；分离胶缓冲液：Tris-HCl缓冲液pH8.9；浓缩胶缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH6.7；分离胶贮液:Acr28.0g,Bis0.735g,无离子水溶解定容至100ml；浓缩胶贮液:Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至100ml；过硫酸铵溶液（AP）电泳缓冲液:Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3；10%SDS固定染色液脱色液(一)垂直平板电泳槽的安装(二)凝胶的制备(三)加样(四)电泳(五)固定和染色(六)脱色五.操作步骤五.操作步骤(一).垂直平板电泳槽的安装注意短玻璃板是向内侧的。要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶。(二).凝胶的制备1分离胶的制备(7%)配8mL(按如下顺序加入）分离胶缓冲液1mL分离胶贮液2mL去离子水4.7mL10%SDS0.08mLTEMED10uL过硫酸胺（AP)0.20mL将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至3/4处，再取大约3mL的水加在上面直至凝胶凝固为止。加入AP后请迅速混匀加样，否则易凝固无法加样凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。3.浓缩胶的制备(2.5%)配4mL(按如下顺序加入）浓缩胶缓冲液0.5mL浓缩胶贮液1mL去离子水2.45mL10%SDS0.04mLTEMED8uL过硫酸胺（AP)0.1mL迅速混匀,用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面,直至上边缘,迅速插入加样梳,室温静置一段时间.※加样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面贴长玻板.凝胶凝聚后，垂直小心拔出加样梳。加入缓冲液除去底板，将制胶装置放在电泳槽内，加入Tris－甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先从内槽加入，上液面超过短玻璃板，外槽液面没过最下一个螺丝处。用微量移液器取10uL蛋白样品，再加入10uL上样缓冲液，80度水浴5分钟。用离心机短暂离心5秒，在梳子产生的加样孔上方，两块玻板夹缝处缓缓进样20uL,取蛋白标准7uL（已经含有上样缓冲液）按同样方法处理，每块平板加入一份蛋白标准。(三).上样(四).电泳将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（方向切勿接错），打开电泳仪开关，将电压调至200V。当蓝色染料迁移至距离凝胶下端2cm时，关闭电源。电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂），将凝胶移至培养皿中染色。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.(五).固定和染色

将凝胶放入固定染色液中，使染色液刚好没过胶板，放到摇床上，缓慢摇动，染色7min。(注意染色液要用漏斗回收）(六).脱色放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪去。

六.实验结果可在培养皿下衬一白纸，便于观察。1、Acr和Bis为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应小心。2、玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的