食品分析整理

农药最大残留限量（MRL）

农药残留是指由于存留在农产品、或食品、饲料、药材等产品中的农药及其降解代谢产物,还包括环境背景中存有的农药污染物或持久性农药的残留物再次在产品中形成的残留。一般来说,农药残留量是指农药本体及其代谢物的残留量的总和,表示单位通常为mg／kg。

当农药过量或长期施用,导致农产品或食物中农药残存数量超过最大残留限量（MRL）时,将对人和动物产生不良影响,或通过食物链对生态系统中其他生物造成毒害。

第一节概述一、食品中农药残留检验的特点1.残留含量低，一般以mg/Kg或ug/Kg计量2.测定时，样品基底物质容易对测定产生干扰。二、样品前处理样品前处理是指在做最后分析以前对样品进行适当处理，制成样液供下一步测定用。一般包括以下三个步骤：提取、净化、浓缩(一)提取

提取指通过适当的方法，把待测物从样品基底分离出来并转移至溶液中。通常采用溶剂分离提取的方法。1.提取方法(1).浸渍法(2).捣碎法(3).索氏提取法(4).加速溶剂萃取法(5).其他方法加速溶剂萃取(ASE)萃取过程用液体溶剂和溶质基体萃取固体或半固体样品用提高温度(40-200ºC)和压力(1500-2000psi)用少量溶剂和短的分析时间对10克样品用15mL和15min广泛应用于全世界的政府机构和实验室ASE可以用于代替索氏，超声波，加热，振摇和其它萃取方法高温的作用增加解吸能力减少溶剂的粘度

被测物扩散进入溶剂更快克服基底效应增加被测物溶解度用更少的溶剂和时间范围从40ºC至200ºC加压的作用加压迫使溶剂进入在低压下受阻的孔隙中加压使高温下溶剂保持液态样品池在高压下快速充满溶剂泵清洗阀炉氮气静态阀收集瓶萃取池充满溶剂

时间(min)0.5-1装样品池静态萃取5用氮气1-2冲洗循环加热和5加压萃取

总计(min)准备12-14用新鲜0.5溶剂冲洗

ASE示意图ASE的步骤:加溶剂于样品池,加热和加压,静态浸湿,用新鲜溶剂冲洗,第3和4步循环,用氮气清洗.(二)净化2.提取溶剂根据待测物的化学性质和样品的种类选择提取溶剂。净化是将样品提取液进行适当的处理，除去一部分干扰物质。1.柱色谱法2.液-液萃取法3.皂化法4.磺化法5.纸色谱法和薄层色谱法6.固相萃取法7.凝胶渗透色谱法(三)浓缩浓缩是指缩小样品处理液的体积。主要原因是由于农药残留量很低，如果溶液体积过大，难于满足分析灵敏度的要求。常用浓缩方法：1.直接水浴浓缩法2.气流吹蒸浓缩法3.减压蒸馏浓缩法第二节有机氯农药残留量的检验一、概述有机氯农药是一大类含有氯原子的有机杀虫剂，常见的有六六六、滴滴涕，狄氏剂、艾氏剂、氯丹、七氯、五氯酚等有机氯农药的化学性质稳定，在环境中残效期长；进入人体后可以在人体内蓄积，对人类健康产生危害。有机氯农药的结构及理化性质（1）六六六

六六六分子式为C6H6Cl6，化学名为六氯环己烷、六氯化苯，英文名为Benzenehexachloride(简称BHC)。BHC有多种异构体，其常见的异构体化学结构式为：

(2)滴滴涕

滴滴涕分子式为C14H9Cl15，化学名为2，2-双(对氯苯基)-1，1，1-三氯乙烷、二氯二苯三氯乙烷，简称二二三，英文名为Dichlorodiphenyltrichloroethane，简称DDT。根据苯环上Cl的取代位置不同形成如下几种异构体：六六六和DDT为脂溶性有机物，进入人体后，都能蓄积在体内脂肪组织里。有机氯农药属低毒和中等毒性杀虫剂，主要对神经系统和肝、肾造成损伤。注意六六六和DDT在食品中的残留限量标准二、食品中六六六、DDT残留量的测定(一)气相色谱法1.原理试样中六六六、DDT经提取净化后用气相-电子捕获检测器测定，与标准对照品比较，以保留时间定性，色谱峰高或峰面积定量。2.样品处理试样制备根据不同样品进行不同的制备方法样品处理用丙酮、石油醚提取、浓硫酸磺化除去脂肪、蜡质和色素等。电子捕获检测器也是一种离子化检测器，它是一个有选择性的高灵敏度的检测器，它只对具有电负性的物质，如含卤素、硫、磷、氮的物质有信号，物质的电负性越强，也就是电子吸收系数越大，检测器的灵敏度越高，而对电中性（无电负性）的物质，如烷烃等则无信号。

4.方法说明(1)方法检出限，具有较高的灵敏度。(2)出峰顺序(3)采用了磺化法用浓硫酸净化提取液。样品提取液中的脂肪和其他一些杂质可与浓硫酸反应，引入磺酸基，分子极性增大，从石油醚中转入硫酸溶液中；有机氯农药对硫酸稳定，仍然保留在石油醚中。(4)在硫酸磺化时，由于有水生成，故体系内存在水份则会影响磺化效果，故含水较高的样品经提取后应用无水硫酸钠脱水，或蒸去提取溶剂后，再用正己烷溶解，使溶液中不含水份；磺化用分液漏斗应烘干，不能用水检漏；磺化用硫酸亦宜使用新开瓶的硫酸。(5)氯原子电负性大，故气相色谱检测时采用电子捕获检测器。电子捕获检测器只对具有一定电负性的元素有响应，其选择性高。同时该检测器对含氯原子的有机物有很高的灵敏度，适于有机氯农药残留的气相色谱测定。第三节有机磷农药残留量的检验一、概述

有机磷农药是一大类具有磷酸酯结构的有机杀虫剂。其种类很多，目前大量生产与使用的至少有60多种。常见的有机磷农药有：敌敌畏、乐果、马拉硫磷等。有机磷农药有特殊的蒜臭味，挥发性大，对光、热不稳定，由于各种有机磷农药的极性强弱不同，故对水及各种有机溶剂的溶解性能也不一样，但多数有机磷农药难溶于水，可溶于脂肪及各种有机溶剂，如丙酮、石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷及苯等，但敌百虫能溶于水。

敌敌畏乐果对硫磷

有机磷农药性质不稳定，应用广泛。但是，某些有机磷农药属高毒农药，对哺乳动物急性毒性较强，常因使用、保管、运输等不慎，污染食品，造成人畜急性中毒，故食品中（特别是果蔬等）有机磷农药残留量的测定，亦是一重要检测项目。有机磷农药的性质

①溶解性：由于各种有机磷农药的极性强弱不同，故对水及各种有机溶剂的溶解性能也不一样，但多数有机磷农药难溶于水，可溶于脂肪及各种有机溶剂，如疏水性有机溶剂：丙酮、石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷及苯等，亲水性有机溶剂；乙脂、二甲基亚砜等。②水解性：因有机磷农药属酯类(磷酸酯或硫代磷酸酯)，故在一定条件下能水解，特别是在碱性介质、高温、水分含量高等环境中，更易水解。如敌百虫在碱性溶液中易水解为毒性较大的敌敌畏。

③氧化性：有机磷农药中，硫代磷酸酯农药在溴作用下或在紫外线照射下，分子中S易被O取代，生成毒性较大的磷酸酯。二、食品中有机磷农药残留量的测定(一)水果、蔬菜、谷类中有机磷农药的多残留测定1.原理食品中残留的有机磷农药经有机溶剂提取并经净化、浓缩后，注入气相色谱仪，气化后在载气携带下于色谱柱中分离，并由火焰光度检测器检测。当含有机磷样品于检测器中的富氢火焰上燃烧时，以HPO碎片的形式，放射出波长为526nm的特征光，这种光通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后，由记录仪记录下色谱峰。通过比较样品的峰高和标准品的峰高，计算出样品中有机磷农药的残留量。特点及适用范围：本法采用火焰光度检测器，对含磷化合物具有高选择性和高灵敏度，可使有机磷农药残留量的最小检出量达到ng级水平，并且对有机磷检出极限比碳氢化合物高10000倍，故排除了大量溶剂和其他碳氢化合物的干扰，有利于痕量有机磷农药的分析。本法适用于粮食、果蔬、食用植物油中常见有机磷农药残留量的测定。2.样品处理水果、蔬菜和谷物样品中加入丙酮水，以捣碎法用组织捣碎机匀浆提取。匀浆液经抽滤，滤液中加入足够的氯化钠固体使溶液处于氯化钠饱和状态。猛烈振摇，静置，丙酮与水相分层。水相用二氯甲烷提取。将丙酮与二氯甲烷提取液合并，无水硫酸钠脱水。旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，浓缩液用二氯甲烷转移并定容。3.测定色谱柱的参考条件以及载气，流速，温度等吸取标准液及试样净化液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。4.方法说明(1)此法用于水果、蔬菜、谷类样品中20中有机磷农药残留的测定。(2)对于植物性样品，可以用丙酮进行提取，丙酮对植物细胞有较强的穿透性。(3)玻璃色谱柱的化学惰性优于不锈钢柱，采用玻璃柱和二甲基二氯甲烷(DMCS)硅烷化担体，能减少对待测组分的吸附，改善色谱峰型。(4)火焰光度检测器通常用来检测含有硫磷元素的有机物。用火焰光度检测器测定有机磷农药有高选择性和高灵敏性的特点。第四节氨基甲酸酯类农药残留量的检验一、概述氨基甲酸酯类农药可视为氨基甲酸的衍生物，氨基甲酸是极不稳定的，会自动分解为C02和H20，但氨基甲酸的盐和酯均相当稳定氨基甲酸酯高温下不稳定，受热易分解氨基甲酸酯为酯类化合物，碱性条件下易水解，生成甲胺和CO2；多数极性较大，提取考虑用极性有机溶剂。

这些氨基甲酸酯农药在农业生产与日常生活中，主要用作杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀软体动物剂和杀线虫剂等。20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，且抗有机磷农药的昆虫品种日益增多，因而氨基甲酸酯的用量逐年增加，这就使得氨基甲酸酯的残留情况备受关注。第五节食品中拟除虫菊酯农药残留的检验一、概述

拟除虫菊酯(Pyrethroids)是近年来发展较快的一类重要的合成杀虫剂；是一类结构或生物活性类似天然除虫菊酯的仿生合成杀虫剂。拟除虫菊酯分子较大，亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小，在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。拟除虫菊酯是在对天然除虫菊花的有效成分及其化学结构研究基础上发展的，具有高效、广谱、低毒和生物降解等特性，拟除虫菊酯和除虫菊酯杀虫剂在光和土壤微生物的作用下易转变成极性化合物，不易造成污染。具有在碱性条件下易分解的特点。主要检测方法是气相色谱法二、食品中兽药残留的来源三、兽药残留的危害四、兽药残留限量标准和检验兽药最高残留限量(MRLVD)是指某种兽药在食物中或食物表面产生的最高允许兽药残留量(单位μg／kg，以鲜重计)。兽药残留——主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的。另外，休药期(是指自停止给药到动物获准屠宰或其动物性产品获准上市的间隔时间)过短，是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。目前动物性食品中兽药残留的主要检测方法有气相色谱法、HPLC、酶联免疫法和仪器联用技术法。第二节抗生素类兽药残留检验抗生素类药物多为天然发酵产物，是临床应用最多的一类抗菌药物，如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应，四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等，极度超敏反应可能导致过敏性休克甚至死亡。一、四环素类使用较多的为四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)四环素类抗生素具有十二氢化并四苯基结构。注意其理化性质；易溶于稀酸和稀碱。(二)HPLC测定四环素类兽药残留1.原理样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分离，紫外检测器检测；保留时间定性，标准曲线法定量。2.样品处理取一定量切碎的肉样食品，用适量5%HClO4振荡提取，将提取液离心，取上清液经0.45um滤膜过滤。3.测定(1)工作曲线的制作(2)样品测定第三节盐酸克伦特罗残留的检验盐酸克伦特罗俗名瘦肉精。结构式：溶于水，乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。化学性质稳定，一般方法不能将其破坏。盐酸克伦特罗是选择性β2-肾上腺素受体激动剂，具有调节动物神经兴奋功能。能够出现急性中毒反应。毒副作用大，禁止在动物饲料添加剂中使用。FDA和WHO规定盐酸克伦特罗在动物体内的最高残留限量为：肉0.2ug/kg，肝0.6ug/kg,肾0.6ug/kg,奶0.05ug/kg。我国规定盐酸克伦特罗在动物体内的残留限量为：马、牛肌肉0.1ug/kg,肝、肾0.5ug/kg；牛奶0.05ug/kg。二、盐酸克伦特罗兽药残留的检验(一)GC-MS测定法1.原理将肉类样品剪碎，用高氯酸溶液匀浆，超声波加热提取，再用异丙醇-乙酸乙酯萃取，浓缩后经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩。经BSTFA衍生后用GC-MS测定。以美托洛尔为内标物，用内标法定量。强阳离子交换（SCX）和弱阳离子交换（WCX）分别是将磺酸基和羧基化学键合在有孔或无孔树脂亲水涂层表面而形成。提取(GB/T5009.192-2003)2.样品处理

(1)提取注意加入NaCl可以调节离子强度，促进分层，防止乳化。最后用缓冲液定容。(2)净化定容的样品用弱阳离子交换柱，依次用乙醇、水、NaH2PO4缓冲液、水淋洗柱子，弃去流出液，洗去杂质。用乙醇+浓氨水洗脱，收集洗脱液，吹N2浓缩至干。(3)衍生化于净化，吹干的试样残渣中加入甲醇和内标工作液，用N2吹浓缩至干，迅速加入衍生剂，密闭，混匀，于75℃衍生化。衍生反应结束后冷却，N2吹干，加入甲苯，混匀待用。同时克伦特罗标准液同时进行衍生化。3.测定4.方法说明(1)本方法检出限为0.5ug/kg，线性范围为0.025ng~2.5ng。回收率为92%~98.7%。(2)采用0.1MHClO4匀浆，超声波萃取，离心和液-液萃取等步骤的效果较好。能够促进残留兽药的溶出，缩短提取时间。(3)液-液萃取是加入NaCl其防止乳化的作用(4)衍生化前经净化处理可防止具有相同官能团的杂志的干扰。(二)HPLC测定法1.原理固体试样剪碎，用5%高氯酸溶液匀浆，超声加热提取，用异丙醇+乙酸乙酯萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+氨溶液洗脱，洗脱液浓缩，用流动相定容，用HPLC测定。2.样品处理样品提取、净化同GC-MS法。处理后的试样残渣中加入适量流动相，充分振摇，溶解，液体浑浊时用微孔过滤膜过滤，取清液进行液相色谱测定。3.测定4.方法说明(1)本法适用于各种肉食品与肝、肾、肺等组织及其汤汁中“瘦肉精”残留检验。(2)盐酸克伦特罗标准溶液应临用时现配，避光保存。标准应用液与样液中待测物易分解，应尽快检验。参考GB/T5009.192-2003

蛋白质的去除1.加入与水混溶的有机溶剂可使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，进而使与之结合的药物释放。常用的水溶性有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。2.加入中性盐使溶液的离子强度发生变化，并将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐等3.加入强酸当溶液的pH值低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根阴离子形成不溶性盐而沉淀析出。常用的强酸：10%三氯醋酸、5%高氯酸、5%偏磷酸等。4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐的沉淀。常用的沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等5.酶解法在测定某些与蛋白质结合牢固，且对酸不稳定的样品时候，可以采用酶解法使蛋白质分解而释放出药物。第二节黄曲霉素的检验(一)理化性质黄曲霉毒素(aflatoxin,简写为AFT)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物，是一类化学结构和性质相近的化合物，目前已分离鉴定出20种以上，其共同特征是均含有二呋喃环和香豆素(氧杂萘邻酮)。B1B2G1G2黄曲霉素分为B族(薄层色谱板上发蓝色荧光)和G族(薄层色谱板上发绿色荧光)。黄曲霉素难溶于水、乙醚、石油醚、己烷等；易溶于甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈、DMF等溶剂。通常条件下很稳定，在268℃以上才发生裂解；在碱性条件下(pH9~10)可以分解成无毒的盐；对强氧化剂也不稳定，可以被氧化剂分解。二、薄层色谱法检测AFTB11.原理样品中AFTB1经甲醇-水溶液提取后，浓缩、定容、点样于硅胶G薄层板上，经展开分离后，在波长365nm紫外光下观察蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光比较来确定含量。2.样品处理样品经正己烷(或石油醚)和甲醇-水溶液振荡提取，样品中油脂、色素等杂质进入正己烷层，而AFTB1和水溶性杂质留在甲醇-水层。用三氯甲烷反提取甲醇-水层，由于AFTB1更易溶解于三氯甲烷，从而进入三氯甲烷层，杂质留在水层。将三氯甲烷层通过盛有无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于蒸发皿中，水浴通风挥干，冷却后，用苯-乙腈（98+2）混合液溶解残渣，作点样液。3.测定(1)定性展开，晾干，在波长365nm紫外光下观察，在Rf值0.6附近有蓝紫色荧光点，说明可能有AFTB1，进行确证试验：点样处滴加三氟乙酸，此时AFTB1水解生成AFTB2a，极性增大，Rf值由原来0.6降到0.1。用于确定是否含有AFTB1。(2)定量根据定性判断结果进一步定量判断是否符合国家卫生标准。类似检测最低检测限的：基本原理：用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的浓度与最低限量浓度之间的对比。

如果单向展开法，存在杂质掩盖AFTB1荧光，采用双向展开法：薄层板先用无水乙醚作横向展开，干扰的杂质展开至样液点以外，AFTB1不动，再用丙酮-三氯甲烷(8+92)作纵向展开，此时AFTB1处杂质大为减少，提高方法灵敏度。三、酶联免疫吸附测定法（ELISA）抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性ELISA方法ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品中农药，兽药残留以及霉菌毒素检测的试剂盒产品。ELISA方法的原理

基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。

直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图。间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图。间接法夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体酶标微孔板酶联免疫吸附测定AFTB11.原理将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有毒素抗原)提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原(AFTB1)含量。2.样品处理粉碎均匀样品，用乙腈-水提取，滤纸过滤，滤液用0.1%牛血清蛋白(BSA)的洗液稀释后，供ELISA检测。3.测定用包被抗原(AFTB1与牛血清蛋白结合物)包被酶标微孔板，4℃过夜。用洗液洗去酶标微孔板多余抗原，加毒素标准溶液或样品提取液，再加入抗AFTB1单克隆抗体，37℃孵育。多余抗体用洗液洗去，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育，再次洗涤酶标微孔板，加底物四甲基联苯胺溶液，37℃孵育后，用硫酸中止反应。4.方法说明(1)ELISA法利用了酶促反应，酶的催化效率很高，故可极大地地放大反应效果，使得该方法达到很高的敏感度。(2)本法检测范围为：0.1ng/ml~1ng/ml。最低检测浓度为0.01ug/kg。(3)注意控制测定条件，保证样品与标准测定条件的一致。(4)ELISA试剂盒应低温保存，并注意有效期。5.方法说明(1)微柱上测定的结果为AFT的总含量。方法检出限为0.5ug/g。(2)层析用的酸性和中性氧化铝、硅镁型吸附剂及层析用无水硫酸钠应在110~120℃活化2h，置于干燥器内可保存1周左右。(3)在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果，最好在2h内进行观察。(4)洗脱废液回收，密闭接受洗脱废液的容器。第四节展青霉素的检验一、概述展青霉素为无色结晶，熔点为110℃，在70℃~100℃可升华，溶于水和乙醇。在碱性溶液中不稳定，而在酸性溶液中较稳定，耐热。展青霉素是由荨麻青霉、扩张青霉和棒曲霉等霉菌代谢产生的。主要存在于腐烂水果及其制品中。是一种神经毒素。我国规定苹果、山楂制品中展青霉素最高容许量为半成品不超过100ug/kg；果汁，果酱，果酒，罐头，山楂条不超过50ug/kg。二、双向薄层扫描测定法1.原理用乙酸乙酯提取果汁，用1.5%碳酸钠净化样品。经双向薄层展开分离后，利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。2.样品处理鲜果、果酱加适量无水硫酸钠研磨吸收多余的水分，加乙酸乙酯振荡浸泡，过滤，滤液加稀碳酸钠溶液振摇，洗去杂质，乙酸乙酯层在水浴上真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷定容，供薄层色谱仪分析。果汁、果酒置于分液漏斗，加入乙酸乙酯振摇，静置分层；重复以上步骤两次，合并有机相，加1.5%碳酸钠振摇，静置分层，弃去水层，同上步骤再用碳酸钠处理一次，合并提取液。乙酸乙酯在水浴上真空减压浓缩至近干，用少许三氯甲烷定容，供薄层色谱分析。标准分析方法：GB/T5009.185-20033.测定薄层板的制备:取硅胶GF2545g，加水15ml，涂布10cm*10cm玻璃板上，一次涂成数块，薄层厚度为0.3mm，晾干，105℃烘烤2h，放入干燥器备用。点样：取一块薄层板，用微量注射器滴加展青霉素标准液、样品提取液。在样品点同一垂直线上，距顶端2cm出点标准液，作为位置参考点。展开:横向展开剂(三氯甲烷-丙酮，30+1.5)展开到顶端后取出挥干，再用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(50+15+1)进行纵向展开至顶端，取出挥干，在254nm紫外灯下观察，在Rf值约为0.35位置出现黑色吸收点则试样可能为阳性。进行扫描定量测定。薄层色谱扫描测定:将可疑阳性样品的薄层色谱板喷以3-甲基,2-苯并噻唑酮腙盐酸(MBTHHCl)溶液，130℃烘烤15min，冷却至室温后，于波长360nm紫外灯下观察，展青霉素应呈橙黄色斑点。经确证试验为阳性的样品根据样液黑色斑点的强度大小，稀释不同倍数后，再点样，使每个样品点展青霉素的绝对量在仪器线性范围内，经双向展开后，进行扫描测定标准及样品中展青霉素峰面积。4.方法说明(1)本方法适合于苹果、山楂制品及半成品中展青霉素的测定。

(2)用此法测定苹果及制品中展青霉素的平均回收率为90%~104%，重复性试验相对标准偏差为2.2%~8.1%，展青霉素最低检出量为2ng，最低检出限为3ug/L。第五节脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验一、概述镰刀菌属产生的有毒代谢产物主要是单端孢霉毒素，目前已分离鉴定出148中该类化合物。它只含有碳氢氧三种元素。谷物中天然污染的单端孢酶烯族化合物分属于A、B两型，结构上12、13位碳原子上形成环氧基，可能是其毒性的化学基础。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)都属单端孢酶烯族化合物的B型结构式。DON相对分子质量296.13，分子式C15H20O6为无色结晶，对热稳定，紫外光下无荧光。NIV的相对分子质量312.12，分子式为C15H20O7，纯品为白色，熔点222℃~223℃，极性比DON强，溶于甲醇、乙醇和水。DON、NIV主要是雪腐镰刀菌污染小麦、玉米、大米、豆饼等粮食和饲料产生的代谢产物。DON、NIV主要毒性表现为细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。我国建议供人食用的谷物中DON含量不得超过1mg/kg。二、DON的薄层色谱测定法1.原理谷物及其制品中的DON经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使DON在波长365nm紫外光下显蓝色荧光，与标准比较。2.样品处理(1):提取准确称取粉碎样品，置于具塞锥形瓶中，加三氯甲烷-无水乙醇(8+2),振荡提取，通过折叠快速定性滤纸过滤，取部分滤液于玻璃蒸发皿中，置水浴上通风挥干。(2)净化:用石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入分液漏斗中，再用少量甲醇-水(4+1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中，振摇，DON留在甲醇-水层，油脂进入石油醚层。将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心沿管壁加入装有中性氧化铝和活性炭的层析柱中，甲醇-水提取液过柱快完毕时，加入少量甲醇-水(4+1)淋洗柱。(3)点样液的制备：将洗脱液倒入玻璃蒸发皿中，置沸水浴上浓缩至干。趁热加入乙酸乙酯，加热至沸，将残渣中的DON溶出，冷却至室温后转入浓缩瓶中，浓缩定容。3.测定在硅胶G薄层板上点样液，同时在薄层板上端与样品点相应的位置上点一个DON标准点，作为定位参考，用乙醚-丙酮或无水乙醚横展，使样品点中DON偏离原点，与杂质荧光分开。挥干溶剂后再在薄层板上点两个等量DON标准点，然后在其中一个点滴加点样液。用纵展剂三氯甲烷-丙酮-异丙醇(8+1+1)或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水(7.5+1+1.5+0.1)展开。晾干后，于波长365nm紫外灯下观察，薄层板可见到显蓝紫荧光的干扰点，而DON不显荧光。然后将此薄层板置130℃烘箱中加热，取出，冷却后，再置于波长365nm紫外灯下观察，DON和杂质点均有荧光，但两荧光斑点明显区分。薄层板经横展后，板上样液点的DON移动约0.7cm~1cm。据此，在此纵展后使样品DON点摆脱杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的DON标准点可作为横展后下端样品DON点和标准DON点的横向定位点，样品DON点又可与纵展后的DON标准点比较Rf值而定性。这样从横向和纵向两个方向确定样品DON点的位置，达到定性的目的。如在薄层板上样液点未显荧光，而样液+标准之点所显荧光强度与标准DON荧光强度相等，则检验结果为阴性。测定方法示意图4.方法说明(1)本方法适用于小麦及其制品(蛋糕、饼干、面包等)和玉米种DON的测定。(2)样品净化时，不要将分液漏斗中两相交界处的白色絮状物放入柱内。过柱速度控制在2ml/min~3ml/min，速度太快净化效果不好，太慢则耗时长。(3)薄层板的制备对分离效果和DON检出灵敏度有很大影响，必须严格按测定方法操作。(4)参考GB/T5009.111-2003第一节食品中有害金属铅、砷、汞、镉的检验一、食品中铅的检验铅常温下呈灰蓝色固体，铅的化合物主要有铅的氧化物和铅盐，其中硝酸铅在水中的溶解度最大。铅锌矿铅锑化铅颗粒(二)氢化物发生原子荧光光谱法1.原理样品经硝酸-高氯酸消化，在酸性介质中，二价铅离子与NaBH4或KBH4反应生成挥发性PbH4，PbH4随载气(氩气)流进入电热石英管原子化器原子化，在特制铅空心阴极灯照射下，基态铅原子被激发，当激发态铅原子回到基态时，发射出特征波长的荧光，其荧光强度与铅含量成正比，标准曲线法定量。2.样品处理取适量样品，加入硝酸-高氯酸混合酸，放置过夜。加热消化至消化液呈淡黄色或无色。稍冷后加水，继续加热至消化液剩下0.5ml~1.0ml为至。加入盐酸和草酸，摇匀，加入铁氰化钾，用水定容。混匀，放30min后测定。同时做试剂空白。3.测定(1)仪器条件(2)测定先连续用标准零管进样，待读数稳定后，进行标准系列的测定，绘制标准曲线。再测定空白消化液及样品消化液，计算出样品中铅含量。4.说明

(1)该法简便、快速、干扰少、灵敏高。检出限为0.4ng/ml，线性范围0~500.0ng/ml。(2)消化过程中，应注意驱酸，以免影响测定。样品消化后加入盐酸是为了维持氢化反应所需要的酸度。(3)标准溶液及样品消化液定容后摇匀，放置30min，使反应完全，还原剂在测定时由氢化物发生装置中加入，同时控制一定酸度和铁氰化钾浓度，以增大吸收信号，提高方法灵敏度。(一)氢化物发生原子荧光光度法1.原理样品经湿消化或干灰化后，加入硫脲使五价砷还原为三价砷，再加入硼氢化钾使三价砷还原为砷化氢，由氩气导入原子化器中，高温下分解为原子态砷，在特制砷空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，其荧光强度在固定条件下与被测溶液中砷的浓度成正比，标准曲线法定量。GB/T5009.11-20032.样品处理(1)湿消化取适量样品，加入硝酸，硫酸，放置过夜，次日加热消化，至完全，除尽氮氧化物，冷却，加入硫脲，用水定容。同时做试剂空白。(2)干灰化法取适量样品，加入硝酸镁溶液混匀，低热蒸干。将MgO盖于其上，先炭化，再于550℃下灰化4h。冷却，小心加入稀盐酸，以中和MgO并溶解灰分。移入容量瓶中，加硫脲，另用稀硫酸分次洗涤坩埚后合并，定容。同时做试剂空白。3.测定(1)仪器条件光电倍增管电压400V。测定方式：荧光强度或浓度直读方式；读数方式：峰面积；读数延时1s，读数时间15s；硼氢化钠加入时间5s；加样体积2ml。(2)测定依次进标准系列，清洗进样器，再用“0”管调试，使读数回零，再测试剂空白和样品，记录荧光强度。基于外光电效应和二次电子发射效应的电子真空器件。它利用二次电子发射使逸出的光电子倍增，获得远高于光电管的灵敏度，能测量微弱的光信号.4.说明(1)本法灵敏度高，检出限为2ng/ml,线性范围为0~200ng/ml；干扰少。(2)样品湿消化时应防止炭化，因碳可能把砷还原为元素态而造成损失。干灰化时，加入硝酸镁加热分解产生氧，可促进灰化作用。氧化镁除了保湿传热以外，还起着防止砷挥发损失的作用。灰化前应将MgO粉末仔细覆盖全部样品的表面。(3)此法测定结果为样品中总砷的含量，也可用于样品中无机砷含量的测定。(二)银盐法1.原理样品经消化后，以KI和SnCl2将高价砷还原为三价砷，然后与锌和酸反应生成的产物氢化反应生成砷化氢，经银盐溶液吸收后，形成红色胶体银，于波长520nm处测吸光度值，用标准曲线法定量。H3AsO4+2KI+H2SO4H3AsO3+I2+K2SO4+H2OI2+SnCl2+HClHI+SnCl4H3AsO3+3Zn+3H2SO4AsH3+3ZnSO4+3H2OAsH3+6AgDDC6Ag+3HDDC+As(DDC)3二乙氨基二硫代甲酸银（AgDDC)分光光度法

As5+As3+AsH3

+2e[H]AgDDC红色胶体银510nm测吸光度As5+↑2.样品处理(1)湿消化法称适量样品，加HNO3-HClO4-H2SO4消化完全，除尽氮氧化合物，定容。同时做试剂空白。(2)干灰化法称适量样品于坩埚，加氧化镁及硝酸镁溶液，混匀，浸泡4h，低温蒸干。在550℃下灰化3h~4h。冷却，加水湿润、蒸干后，灰化2h。加稀盐酸溶解残渣，用水定容。同时做试剂空白。3.测定取一定量的样品消化液和同样量的试剂空白液及砷标准溶液，加水，加硫酸使酸度一致。如果是灰化法处理的消化液，加盐酸使酸度一致。各加KI和酸性SnCl2，混匀，静置。加锌粒，立即塞上装有乙酸铅棉花的导气管，并使导气管尖端插入盛有银盐吸收液的离心管液面下，常温下反应45min。以零管调零，于520nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算样品中砷含量。4.说明(1)样品湿消化时，若为含水分少的固体样品应粉碎过筛，混匀再称量。若为蔬菜、水果或水产品，应匀浆后再称量。若为酒精性或含二氧化碳饮料，应先称量，微火加热去除乙醇或二氧化碳后再消化。(2)湿消化法处理样品应在消化后加水煮沸处理两次，除去残留的硝酸，以免影响反应、显色和测定，使结果产生误差。(3)样品中的硫化物在酸性溶液中形成H2S，随AsH3一起挥发出来，进入吸收液，与AgDDC反应生成Ag2S沉淀，影响显色和测定，所以在导气管中装入乙酸铅棉花以消除其影响。(4)吸收液的组成为2.5g/LAg-DDC，18ml/L三乙醇胺，三氯甲烷为溶剂。其中三乙醇