DBI讲座qPCR技术细节决定成败

中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士DBIBioscience5年资深专家

党希龙程涛细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响DBIBioscience主要做什么？我们有哪些优势产品？我们为中国的客户带来更好的..........FREE!!!DBIBioscience实验设计试剂使用仪器使用技术细节结果分析新的选择我们的生产地——路德维希港（德国）我们为您提供欧洲领先的QPCR试剂我们在网络存在：严谨、科学、质量可靠，技术先进、选材严格，良好的技术性和耐久性、不计成本节能、成本控制好，舒适性和使用便利性最大一些不容易被发现的零部件质量低，qPCRMix对比实验3种qPCRMix包括：SYBRGreen法：SYBRPremixExTaq(Tak公司)StormStarSybrGreenPCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）第1部分模板：人源cDNA引物：IC1(forSYBRGreen)SYBRGreen:Mix10uLRox0.4uLTemplate4uLPrimerF(10uM)2uLPrimerR(10uM)2uLH2O1.6uL95℃5min95℃15s50℃45s40cycles使用7300荧光定量PCR仪进行检测Tak公司SYBRPremixExTaqStromStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）扩增曲线Tak公司SYBRPremixExTaqStromStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）总结1将cDNA模板进行浓度梯度稀释(10ng/well-1fg/well)，分别加入3种SYBRGreen

Mix，使用IC1引物进行扩增，Ct值与模板浓度有较好的线性关系，其中:Tak公司SYBRPremixExTaq：R²=0.999StromStarRealtimePCRMasterMix：R²=0.999BeStarSybrGreenqPCRMasterMix：R²=0.998说明在模板浓度较低的情况下(1fg/well)，各Mix仍能使扩增反应保持特异性；2.3种SYBRGreenMix之间扩增效率没有明显区别；第2部分qPCRmix扩增miRNA的效果比较qPCRmixSYBRGreen法：SYBRPremixExTaq(Tak公司，批号A3701)SYBRPremixExTaq(Tak公司，批号A4504)StormStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）Mix10uLRox0.4uLTemplate(hsacDNA)5uL(1ng)PrimerF(10uM)2uLUPM(10uM)2uLH2O0.6uL95℃5min95℃15s50℃45sDissociationCurve40cycles2.1.Ct值比较绿色标记：引物特异性较好(溶解曲线为单峰)橙色标记：引物特异性较差(溶解曲线出现双峰等)miR-18a-5p2.2.扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStar当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；miR-141-5p2.3扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStar当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，4种mix扩增效果差异较大。miR-139-3p2.4扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStarStormStarT-A3701T-A4504BesStar扩增miR-139-3p时，Tak公司(A3701)，Tak公司(A4504)及DBIBeStar扩增曲线也不正常，溶解曲线也均出现乱峰，仅DBIStormStar（DBI-2143）扩增曲线正常，溶解曲线为单峰。当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；

当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，4种mix扩增效果差异较大，整体说来DBIStormStar和DBIBeStar比Tak公司(A3701)Tak公司(A4504)的Ct值更小；Tak公司mix两个批次之间(A3701和A4504)没有明显差异；DBIBeStar与两种Tak公司mix没有明显差异；使用质量较差的引物时，

DBIStormStar具有更高的特异性(相比另外3种mix)；小结2SYBRGreen

mix检测批次：BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-619（DBI-2043）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-621（DBI-2043）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-623（DBI-2043）SYBRGreenqPCRMasterMix（Tak公司，A4504）第3部分三批次DBISYBRmix与Takara的对比实验Mix10uLRox0.4uLTemplate(血浆cDNA)0.1uLPrimerF(10uM)2uLUPM(10uM)2uLH2O5.5uL95℃5min95℃15s60℃45sDissociationCurve40cycles3.1.Ct值比较橙色标记：DBI三个批次的mix扩增Ct值明显小于Tak公司其他无标记：DBI三个批次的mix之间与Takara之间均无明显差异miR-13.2.扩增曲线及溶解曲线举例当引物扩增Ct值较大（30左右，且引物特异性较差）时，DBI三个批次的扩增性能优于Tak公司mix。BesStarT-A4504BesStarT-A4504miR-22-3p3.3.扩增曲线及溶解曲线举例当引物扩增Ct值较小（正常扩增）时，DBI三批次的扩增性能等于Tak公司mix。但融解曲线相对更好。BesStarT-A4504BesStarT-A4504

当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，DBI三种mix扩增效果没有明显区别，但Ct值数据都小于Tak公司mix；使用质量较差的引物时，

选用DBImix可以得到更优的数据，但需补充阴性对照数据来进行判定；小结3使用DBIBioscience的qPCR(SYBRGREEN)最近发表的文章（影响因子20.22分）VEGFR-3inMacrophages

RestrainsTLR4-NF-κBSignaling

andProtectsagainstEndotoxinShock张彦波May13,2014上海中科院生化细胞所内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理

扩增曲线荧光阈值

Ct值荧光定量PCR原理

在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。

反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。

PCR产物的积累规律PCR产物的积累规律示意图荧光定量PCR定量原理扩增曲线荧光定量PCR定量原理为什么终点定量不准确呢？荧光定量PCR定量原理尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cyclethreshold）与模板起始浓度有密切联系。Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值荧光定量PCR原理－－荧光阈值定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理定量PCR的数学原理线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认NoTemplateControl(NTC)确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.135Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（r2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法非特异性荧光标记

SYBRGreenI特异性荧光标记

TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：

SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：

设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线

对DNA模板没有选择性

使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点

容易产生假阳性对引物特异性要求较高不能进行多重定量缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立Taqman探针法——荧光标记物的选择

高度特异性重复性好可进行多重定量优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点不同定量方法的比较

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项样品制备模板准备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器软件RT上机反应体系优化试剂选择分析方法样品制备环境要求模板准备数据分析RT上机浓度确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具高纯度，浓度均一的RNA分光光度计检测电泳检测（28s,18s,5s）保存，分装RT反应体系优化试剂选择样品制备模板准备数据分析上机AMVM-MLVDBIBioscienceQuantSuper下游反应数确定反转录体积选择应用引物，反应效率高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项模板准备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区冰上操作制作标准曲线设定浓度区间评价引物使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和阴性对照试用于机器要求浓度的ROX校正染料均一的反应液和模板混合物GC％：50－60％Tm：55－60℃单个碱基重复＜4个无二级结构扩增长度：50－150bp引物位置（逆转录的效率跨内含子）反应体系优化上机反应条件优化RT样品制备模板准备数据分析反应体积＞5ul，推荐20－50ulMg2＋调节，酶活调节引物浓度优化，模板量优化退火温度优化：梯度PCR延伸时间：产物长度决定扩增效率：90％－110％重复性：std＜0.2标准曲线：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照45oC55oC65oC溶解曲线扩增曲线1.95oCfor15min2.94oCfor10sec3.Gradientfrom45oCto65oCfor15sec4.72oCfor30sec5.83oCfor1sec6.PlateRead7.Gotoline239moretimes8.Meltingcurvefrom65oCto95oC,read

every0.2oC,hold1sec.Real-timePCR体系优化技能要求误差控制上机试剂选择RT样品制备模板准备数据分析自配DBIqPCRmastermixRoche-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分装控制内参控制机器校正控制平滑曲线，重复性好，灵敏度高SYBR法实验流程及注意事项误差分析及操作规范同一cDNA样品的三个重复误差分析及操作规范如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。1.模板浓度越低，染料法的误差越大误差分析及操作规范2.某一孔荧光信号特别强原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；3.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，误差分析及操作规范4.部分样本扩增效率过低原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；误差分析及操作规范5.

阴性对照或空白对照翘尾原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；误差分析及操作规范6.直线型扩增曲线原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；误差分析及操作规范7.山坡形曲线原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。误差分析及操作规范举例说明：8.扩增曲线断裂原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据误差分析及操作规范9.基线下滑原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；误差分析及操作规范10.没有扩增曲线原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段；②电脑设定了自动休眠；误差分析及操作规范11.扩增曲线有一向上或向下的尖峰原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；误差分析及操作规范数据分析软件系统分析方法上机RT样品制备模板准备相对定量：2－△△Ct法绝对定量：标准曲线法可靠，准确的数据SYBR法实验流程及注意事项内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系

根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒标准品的制备拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算

方法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测

试剂：DBI公司SYBRrealtimePCR试剂标准品：质粒标准品浓度为106、105

、104

、103

；2个重复；设阴性空白对照

实验步骤：提取RNA并反转录；设计特异引物；

荧光定量扩增；结果分析：获取样品中目的基因的精确copy数。绝对定量实验例实验数据绝对定量实验例扩增效率（E）计算

E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1

=2.03－1

＝1.03标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988绝对定量实验例

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想。未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36

=229087copies绝对定量实验例X=20.5-37.52-3.1726=5.36相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

双标准曲线法

2-△△Ct法

相对定量分析——两种常用的分析方法

通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析——双标准曲线法实验数据公式：F=2－相对定量分析——2-△△Ct法优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂应用：基因表达调