第16章抗生素类药物的分析-LLQ

第十六章抗生素类药物的分析思考与练习第一节概述第二节β–内酰胺类抗生素

第三节氨基糖苷类抗生素第四节四环素类抗生素第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查基本要求基本要求一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。返回第一节概述一、抗生素的定义抗生素是指：在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称。抗生素的来源1.生物合成（微生物发酵）2.化学合成或半合成抗生素药物的特点：化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差二、分类（按结构与性质）：

β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类返回三、抗生素类药物的细菌耐药性细菌耐药性：是指细菌产生的对抗菌药不敏感的现象，是细菌自身生存过程的一种特殊表现形式。（一）鉴别试验1.官能团的显色反应：

β–内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应。2.光谱法3.色谱法4.生物学法四、抗生素药物的质量分析抗生素质量的复杂性：产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂（二）检查发酵液中杂质无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌[检查]微生物学法与理化法的比较微生物检定法理化法以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标衡量抗生素的生物效价

根据抗生素结构特点，利用其特有的理化性质测定其含量已知或新发现的抗生素、精制品或粗制品均能测定

测定化学结构已知、已提纯的抗生素灵敏度高、样品需用量小、反映抗生素的医疗价值，但操作步骤多、费时、误差大

迅速、准确、专属性高、样品需用量小、操作简单、省时（三）含量或效价测定微生物检定法测定抗生素抑菌或杀菌的能力管碟法浊度法1.微生物检定法优点1、与临床效果一致2、灵敏度高3、干扰物质少缺点1、操作繁琐2、培养时间长2、测定误差大2.化学及物理化学方法以理化方法测定主药含量优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价缺点2.易受杂质干扰3.抗生素的活性以效价单位来表示：每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位（u）或µg

表示。

1mg青霉素G钠盐定为1670单位

同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量进行换算，如：

1mg青霉素G钾盐的单位（u）

=1670×356.4/372.5=1595u/mg分类（按结构与性质）：

β–内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类返回第二节β–内酰胺类抗生素

青霉素族ABA：β–内酰胺环B：氢化噻唑环***1234头孢菌素族A：β–内酰胺环B：氢化噻嗪环AB**23456178头孢菌素类AB青霉素（青霉素G、苄青霉素）氨苄西林

（氨苄青霉素）阿莫西林

（羟氨苄青霉素）普鲁卡因青霉素头孢拉啶头孢氨苄头孢羟氨苄头孢噻吩钠酸性结构与性质一、Na与碱金属(Na+、K+)成盐

（一）羧基易溶于水

酸白色沉淀与有机碱(普鲁卡因)成盐

难溶于水普鲁卡因青霉素（二）手性C

头孢菌素类

C6C7青霉素类C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共轭体系

头孢菌素类母核有共轭体系

青霉素类母核无明显UV

多数有苯环取代基

UV（四）β–内酰胺环

水溶液不稳定

干燥纯净稳定

不稳定性因素四元环张力大

酰胺键易水解

青霉素类某些氧化剂酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（温度）降解失效例青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2头孢菌素类酸、碱、胺类-内酰胺酶降解失效（一）呈色反应1.羟肟酸铁反应β-内酰胺类呈色羟肟酸衍生物Fe3+/3H+鉴别试验二、NaOH•2HClNOHH-b内酰胺类H+Fe3+/3（红、棕、褐）2.茚三酮反应

α-氨基-氨基茚三酮蓝紫色3.双缩脲反应似双缩脲

（开环分解）-内酰胺类碱性硫酸铜紫蓝紫色4.与重氮苯磺酸反应橙黄色重氮苯磺酸-56OHHC（偶合）酚羟基头孢哌酮5.与变色酸-硫酸反应活泼“-CH2-”青霉素阿莫西林氨苄西林△（分解）变色酸显色1.K+、Na+的火焰反应（二）各种盐的反应

焰色→鲜黄色

+醋酸氧铀锌→↓黄

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼钠

+Ac→↓白

K+2.沉淀反应（青霉素盐）遇酸→↓在过量HCl或有机溶剂中溶解白青霉素青霉素钠

青霉素钾

緘+H3.重氮化-偶合反应

重氮化-偶合反应芳伯氨基普鲁卡因普鲁卡因青霉素红色1、IR法3180cm-1N-Hβ–内酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O以阿莫西林为例（三）光谱2、UV法样品、分解产物Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠

A280nm/A264nm=1.30～1.50pH3.8分子重排色谱法（四）1、TLC法对照品对照法2、HPLC法三、特殊杂质的检查

药物

检查项目

检查方法

头孢他啶聚合物

分子排阻色谱

头孢曲松钠

头孢哌酮钠

头孢噻肟钠

头孢呋辛酯有关物质和异构体

HPLC法

青霉素钾（钠）吸收度UV

1.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

固定相：ODS

流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）

1）头孢呋辛酯Δ3-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯Δ3-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。

3）异构体：

2、吸光度检查目的：控制杂质含量检查药物：青霉素钠（钾）

检查方法：1.80mg/ml水溶液；

A280nm<0.10A264nm=0.80~0.883、有机溶剂氨苄西林钠：二氯甲烷（GC）头孢哌酮钠：丙酮（GC）头孢硫脒：二氯甲烷，乙醇，丙酮（GC）头孢他啶：吡啶（HPLC）Fe3+/3H+红色NaOHHClNOH·H2-b内酰胺类羟肟酸衍生物四、含量测定1、可见-紫外分光光度法---羟肟酸比色法USPJPHPLC法2、ChP

内标法＋校正因子外标法特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好

一法多用（鉴别、检查、含测）返回第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素碱性环己多元醇链霉素链霉胍

+链霉糖

+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖链霉双糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺巴龙霉素D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖巴龙糖胺苷元巴龙二糖胺

糖D-葡萄糖胺脱氧链霉胺D-核糖巴龙霉糖庆大霉素

糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3

庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

庆大霉素C1aR、R1、R2=H

庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）链霉素

pH5～7.5庆大霉素

pH2～12稳定稳定性（四）UV（三）链霉素230nm坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应二、鉴别

茚三酮反应（一）△氨基糖苷结构Molisch试验（二）五碳糖或六碳糖结构α-萘酚蒽酮红紫色蓝紫色红紫色N-甲基葡萄糖胺反应（三）甲基葡萄糖胺巴龙霉素链霉素水解-N乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色（Elson-Morgan反应）庆大霉素(缩合)红色对二甲氨基苯甲醛H+

麦芽酚反应（四）

链霉素特征反应H+分子重排紫红麦芽酚链霉胍特有反应（或α-萘酚）8-羟基喹啉坂口反应（五）α-萘酚（六）反应H+UV法（七）庆大霉素无UV吸收nmmax230=l链霉素（八）色谱法（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别

点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色

对照液

判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位置应一致。

点样：供试液

对照液①：硫酸链霉素标准品

对照液②：硫酸链霉素标准品+硫酸新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品

判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小应与对照液①相同，

对照液②应显示分离清晰的3个斑点否则试验无效。

（2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别

比较供试液与对照液各组分的保留时间。三、特殊杂质检查链霉素杂质（一）链霉素B（甘露糖链霉素）

方法TLC中的对照品法（BP）1.

来源反应中间体对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同工艺差别C组分比例不一致规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素C组分的测定（二）++410.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.1-烷基-2-烷基硫代异吲哚衍生物离子对色谱法方法2.规定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%计算3.峰面积归一化法4.蒸发光散射检测器（ChP2010）5.电化学检测器（BP）四、含量测定微生物检定法各国药典主要采用HPLC法常用于体内药分返回链霉素、庆大霉素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。第四节四环素类抗生素ABCD123456789101112四环素（TC）tetracycline765金霉素(CTC)

chlortetracycline氯四环素765土霉素(OTC)

oxytetracycline氧四环素765多西环素(DOTC)doxycycline脱氧土霉素765美他环素（METC）

metacycline765一、结构与性质两性（一）1.与酸、碱均能成盐2.强酸或强碱中溶解度↑

酚羟基、烯醇型羟基

弱酸性二甲胺基弱碱性与金属离子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+

UV和荧光性质（三）与金属离子络合（四）pH3~7.5荧光

（二）旋光性不稳定性（五）1.差向异构化差向金霉素差向四环素金霉素四环素～-4-462pH淡黄→黑蓝色荧光差向四环素（土霉素、多西环素不易差向异构化）2.降解反应（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黄色脱水金霉素脱水四环素金霉素四环素＜2pH脱水四环素～～TCETCATCEATC＜＜（2）碱性下降解（荧光）二、鉴别试验浓H2SO4反应（一）黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH盐酸美他环素橙红色FeCl3反应（二）褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeClCl-反应（三）1mol/L盐酸-甲醇（1→100）0.01mg/mlUV法（盐酸美他环素）（四）TLC法（五）盐酸土霉素的鉴别

HPLC法（六）EDTA

克服痕量金属造成的拖尾现象比较保留时间三、特殊杂质检查

·4-差向四环素（ETC）

·脱水四环素（ATC）

·差向脱水四环素（EATC）

·盐酸金霉素（CTC）

有关物质（一）HPLC法（2010版）盐酸四环素吸收度（二）nmmax355268l、盐酸四环素杂质吸收度取供试品配成每毫升10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，自加0.8％NaOH起5min时，其吸收度不得超过0.12。应严格控制温度和时间四、含量测定HPLC法盐酸四环素的测定

系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的

分离度均应符合要求。

定量方法：外标法以峰面积计。

返回第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查1.高分子杂质分子量大于药物本身的杂质总称。蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。

药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。

外源性杂质内源性杂质

3.高分子杂质的质控方法

（1）凝胶色谱法测定高分子杂质原理：使高分子杂质与药物分离。

（2）高分子杂质的控制方法---自身对照外标法

原理：测定在Kav=0处药物缔合物的峰响应指标

样品中高分子杂质的响应指标

按外标法计算，得样品中高分子杂质相当于药物本身的相对含量。

（3）高分子杂质的分析方法

简单测定系统：葡聚糖凝胶G-10（40～

120μm）柱.

HPLC系统:葡聚糖凝胶G-10柱.

返回练习与思考[A型题]

1、下列哪个药物会发生羟肟酸铁反应A.青霉素B.庆大霉素C.土霉素D.链霉素E.维生素C练习与思考[A型题]

2、中国药典(2010年版)测定头孢菌素类药物的含量时，多数采用的方法是A.微生物法B.碘量法C.汞量法D.正相高效液相色谱法E.反相高效液相色谱法练习与思考[A型题]

3、能发生重氮化-偶合反应的抗生素类药物是A.青霉素B.庆大霉素

C.苄星青霉素

D.盐酸四环素

E.普鲁卡因青霉素练习与思考[A型题]

4、四环素在酸性条件下的降解产物是A.差向四环素B.脱水四环素C.异四环素D.去甲四环素E.去甲氧四环素练习与思考[A型题]

5、庆大霉素和链霉素可以发生Molisch反应，因为它们分子结构中含有A.羰基

B.五碳糖或六碳糖C.羧基

D.羟基E.氨基练习与思考[A型题]

6、麦芽酚与硫酸铁铵作用显示的颜色是A.紫红色

B.黄色C.橙红色

D.绿色E.蓝紫色练习与思考[A型题]

7、盐酸四环素中有关物质的检查在《中国药典2010版》中采用的方法是A.GC-MS

B.IRC.HPLC

D.UVE.TLC练习与思考[A型题]

8、能区别链霉素和庆大霉素，为链霉素特有的鉴别反应是A.茚三酮反应

B.三氯化锑反应C.坂口反应

D.硫色素反应E.N-甲基葡萄糖胺反应练习与思考[A型题]

9、青霉素在碱性或青霉素酶作用下发生降解反应的产物是A.青霉烯酸

B.青霉醛C.青霉酸

D.青霉噻唑酸E.青霉胺练习与思考[A型题]

10、四环素在碱性溶液中发生降解的产物是A.异四环素

B.青霉烯酸C.差向脱水四环素

D.脱水四环素E.差向四环素练习与思考[A型题]

11、可发生N-甲基葡萄糖胺反应的药物是A.硫酸奎宁

B.硫酸阿托品C.盐酸美他环素

D.青霉素钠E.硫酸庆大霉素练习与思考[A型题]

12、具有6-APA母核结构的药物是A.氨苄西林钠

B.头孢他啶C.盐酸金霉素

D.硫酸庆大霉素E.氢化可的松练习与思考[A型题]

13、在紫外区无吸收的药物是A.青霉素钠

B.盐酸土霉素C.盐酸金霉素

D.硫酸庆大霉素E.硫酸链霉素[B型题]

A.青霉素