荧光定量PCR技术2010110生物科学-分子生物学

―qPCR系统“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案生物化学与分子生物学教研室内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法

荧光定量实验流程及注意事项荧光定量应用及实例实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义荧光定量PCR原理－－常用名词概念介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线2.荧光定量标准曲线

Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphase

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）真正的信号:荧光信号超过域值，进入指数扩增期之后荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段Threshold荧光定量PCR原理－－荧光域值平台期Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值同一个样品重复96次PCR的扩增曲线

荧光定量PCR原理－－PCRvsqPCRCt值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为CtXCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：在阈值设定以后，XCt是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

起始模板量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample25线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认标准曲线斜率:-3－-3.535Cycles内可得到好的定量结果（科研领域）如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（R2）：大于0.98荧光定量PCR反应有效性的确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.2

定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等

绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，

GMO定量检测等

相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯

片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法

SYBR法实验流程及注意事项

TIANGEN公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记

SYBRGreenI特异性荧光标记

TaqManProbe分子信标常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理

SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理

SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位

SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，

SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen

SYBRGreenI染料法——作用机理CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少

Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSingleamplifiedproduct溶解曲线检测引物特异性MeltcurveshowingtwoamplifiedproductsSYBRGreen法------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreen法应用范围

起始模板的测定融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点问题点：

SYBRGreenI与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：

设计合适引物，防止非特异性扩增！Taqman探针法——原理

5′端标记有报告基团(Reporter,R)3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光1、引物、探针的设计原则：探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<200bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的设定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

------阴性结果确定设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点实时荧光定量PCR的分类－－几种方法的比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断Molecularbeacon法(分子信标)——原理标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针Molecularbeacon(分子信标)工作原理

荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光

-----变性过程：产生非特异性荧光

-----延伸过程：不产生荧光

------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecularbeacon(分子信标)应用范围

起始模板的定量基因型分析产物鉴定

SNP（单核苷酸多态性）分析Molecularbeacon(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点

只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点内容概要

荧光定量PCR原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法

SYBR法实验流程及注意事项

TIANGEN公司荧光定量产品选择指南荧光定量PCR的解析方法（依据课题要求提前确定）绝对定量解析方法相对定量解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义

Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品,可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系

根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量质粒标准品的制备PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014

倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算实时荧光定量PCR法绝对定量方法方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）

标准品：质粒标准品浓度为106、105

、104

、103

；2个重复；设阴性空白对照

实验步骤：提取HBVDNA；

设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率

－1=10-1/-3.29

－1

=2.01－1=1.01标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.29x+40.33R2=0.9978绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。

未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03

=1,071,519copies绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量X=20.5-40.33-3.29=6.03相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法

根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

实时荧光定量PCR法TaqMan法举例TaqMan法研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异TaqMan法举例标记探针使用TaqMan探针进行双通道荧光定量

Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针TaqMan法举例材料准备从正常乳腺组织中提取的总RNA从乳腺癌组织中提取的总RNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行，独立分析

ControlsnoRNA：阴性对照RNA+noreversetranscriptase：基因组对照TaqMan法举例癌症标记物表达Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法举例实验结果定量Copiesng/µlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法举例实验结果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/µlTotalRNATaqMan法举例实验结果表达差异HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表达差异TaqMan法举例实验结果讨论通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍双标准曲线法

2-△△Ct法(CT值比较法)

相对定量分析——两种常用的分析方法

通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析——双标准曲线法检测样品管家基因H目的基因X定量结果定量结果校正值相对量对照样品6391.5343.40.05371.000待测样品18589.717.30.00200.037待测样品27432.91946.10.26184.874实验数据公式：F=2－相对定量分析——2法优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率接近100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值－－－－△△Ct｛｝实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.40.950.952-

△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%△Ct（处理前）＝18－17＝1△Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的5.3倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于1，那么2－△△Ct可以修正为：（1＋E）－△△Ct，例如扩增效率为0.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct相对定量分析——2-△△Ct法内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法

SYBR法实验流程及注意事项

TIANGEN公司荧光定量相关产品荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源热循环－加热、制冷样品检测设备SYBR法实验流程及注意事项样品制备定量体系配备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法RNA制备环境要求定量体系配备数据分析RT上机质量确定SYBR法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具纯度高、完整性好的RNA分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化试剂选择样品制备定量体系配备数据分析上机AMVM-MLVQuant下游反应数确定反转录体积引物的选择高效、全长的cDNASYBR法实验流程及注意事项定量体系配备引物设计浓度确定环境要求误差控制RT样品制备数据分析上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间使用mix降低系统误差设置重复（≥3次）设置空白和