血红蛋白的提取选修一

课题三血红蛋白的提取和分离

1.知道凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子技术的基本原理。2.掌握血红蛋白提取和分离的基本过程。（预习教材15分钟）

学习目标思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。1．凝胶色谱法

(1)概念也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。分配色谱法相对分子质量的大小凝胶是什么？(2)原理

由

构成的凝胶，内部有许多贯穿的

。多孔球体通道1．凝胶色谱法

当

不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量

的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

。而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以

。相对分子质量较小较长较慢较大凝胶外部较短较快分离【例】

下图中，可表示为相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的移动过程的是 ()B【巩固】凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是 ()A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B．根据蛋白质相对分子质量的大小C．根据蛋白质所带电荷的多少D．根据蛋白质溶解度的大小B2.缓冲溶液1、作用：能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值

在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是（），目的是利用缓冲液模拟细胞内的（），保证血红蛋白的正常（），便于观察红色和材料的科学研究活性。磷酸缓冲液PH环境结构和功能2.缓冲溶液(1)概念指

在电场的作用下发生

的过程。(2)原理在一定的

下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上

或

，在电场的作用下，这些带电分子会向着

的电极移动。带电粒子迁移pH正电负电与其所带电荷相反3．

电泳(3)作用电泳利用了待分离样品中各种分子

的差异及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中

。(4)方法常用的电泳方法有

和

。测定蛋白质分子量时通常使用

。带电性质大小形状迁移速度各种分子的分离琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳3．

电泳使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异[思维激活]

凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同？提示凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小，形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。血红蛋白提取和分离的实验操作

实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。A样品处理及粗分离(1)红细胞的洗涤采集血样，

，吸取血浆后加

，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去杂质，以利于后续步骤的分离纯化。血红蛋白提取和分离的实验操作

样品处理粗分离纯化纯度鉴定低速短时间离心生理盐水(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞依次加入

至原血液体积、40%体积的

，置于磁力搅拌器上搅拌10min，使红细胞吸水

，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到

中，以2000r/min的速度

10min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。蒸馏水甲苯涨破离心管离心血红蛋白提取和分离的实验操作

分离血红蛋白溶液有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）（4）透析(粗分离)a过程：b目的：c原理：除去样品中分子量较小的杂质；用于更换样品的缓冲液。透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。B凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安装

。(2)凝胶色谱柱的装填。(3)样品的

。色谱柱加入和洗脱血红蛋白提取和分离的实验操作

（2）凝胶色谱柱的装填材料：

凝胶的前处理：交联葡聚糖凝胶（G-75）配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。（2）凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。（2）凝胶色谱柱的装填50cm高注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。（3）样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。样品的加入和洗脱的操作不正确的是A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心的将1ml透