分光光度技术3-4

第二章

分光光度技术分光光度技术

分光光度技术(分光光度法)主要是指利用物质特有的光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的发展:比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40－120nm，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3－5nm，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。分光光度技术基本原理

分光光度计

基本结构简介

分光光度技术的基本应用

分光光度法的误差

分光光度技术基本原理一、光的基本知识

光是由光量子组成的，具有二重性，即不连续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光的波动性的特征，可用下式表示：

Ｃ

λ＝───

Ｖ

式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。Ｃ为光速等于299770千米／秒。光属于电磁波。自然界中存在各种不同波长的电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ=1,000nm）之间。其中200nm－400nm为紫外光区，400nm－760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。自然界的电磁波谱

自然界的电磁波谱①γ射线(γ-ray)它是放射性物质发出的电磁波,波长在2×10-10m以下。是一种能量很大的光子流。在医疗上用γ射线作为“手术刀”来切除肿瘤,叫做γ刀,有很好的治疗效果。②X射线(X-ray)它是由X射线管产生的电磁波，波长在10-15~10-7m，X射线对不同密度的物质有不同的穿透力。在医学上常用作医疗检查。在飞机场安全检查中，也常用X射线对行李进行透视查验。自然界的电磁波谱③紫外线(ultravioletray)当光电流通过两电极间的电离气体时，会产生紫外线。其波长在4×10-8~4×10-7m。太阳光中含有紫外线。紫外线能激发荧光，日光灯就是管内紫外线激发涂在灯管内壁上的荧光粉而发出的近似日光光谱的照明灯。紫外线也常用在医学上杀菌和防伪技术上。自然界的电磁波谱④可见光(visiblelight)它是能引起人的视觉感觉的电磁波，其波长范围是0.4×10-6~0.8×10-6m。太阳能发出可见光。可见光是由不同比例的七色光(红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫)所混合组成。⑤红外线(infraredray)通常情况下由灼热物体发出的电磁波，其波长范围是0.8×10-6~1×10-3m。它们会导致物体温度的升高。红外电磁波在特定的红外敏感胶片上能形成热成像。自然界的电磁波谱⑥微波(microwave)——常用于雷达设备上的波长很短的无线电波，其波长范围在1×10-3~1m。由于微波的定向性好，常用发射、反射波的时间来测算目标的位置。微波炉是一种用微波的热效应来烹调食品的装置。⑦无线电波(radiowave)它是在电磁场的作用下无线电天线中自由电子发生振荡而产生的电磁波。波长范围在0.75×10-3~1×104m。分光光度技术基本原理朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律

吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比.A＝－lgT＝KLCA——吸光度，又称光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I。-为照射到吸收池上的光强，I-为透过吸收池的光强。k——摩尔吸光系数（L·mol－1·cm－1）。L——样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，L=1cm。C­——样品浓度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“k”和物质的浓度“C”成正比。分光光度技术基本原理吸光系数K取决于入射光的波长，溶液的性质和温度等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。在一定波长下，它是物质的特性常数。不同物质可能有相同的最大吸收波长，但其吸光系数不一定相同。K值愈大，说明该物质溶液对光吸收愈强烈，则比色测定的灵敏度愈高。分光光度技术基本原理吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：A＝k1L1C1＋k2L2C2＋k3L3C3＋……即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。分光光度计基本结构简介

分光光度计基本结构简介

能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。

基本结构简介----光源

光源要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。汞灯发射的不是连续光谱，能量绝大部分集中在253.6nm波长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。基本结构简介

----单色器分光系统（单色器）

单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石英棱镜工作波长范围为185---4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm，而在长波段只能达到5nm。有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。基本结构简介----狭缝、样品池狭缝

狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。比色杯

比争杯也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。基本结构简介----检测系统

有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。

基本结构简介----检测系统光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。基本结构简介----检测系统检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。721型可见分光光度计工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计工作波长：340-1000nm721系列可见分光光度计（扫描型）配置：简，操作软件、定量分析、时间扫描，可选配打印机、计算机751型紫外可见分光光度计工作波长：200-1000nm755PC型紫外可见分光光度计标配：操作软件、定量分析、时间扫描、光谱扫描，可选配打印机、计算机UNICO-2102紫外可见分光光度计工作波长：200-1000nm分光光度技术的基本应用测定溶液中物质的含量单一物质的定量分析先测出其吸收光谱曲线，找出最大吸收波长。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；⑵可以避免其它物质的干扰。可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。

分光光度计的应用----定量分析混合样品的定量分析吸收光谱不重叠的混合物定量方法-----互不干扰分别测定吸收光谱重叠的混合物定量方法采用化学计量学方法可以克服光谱定量分析中出现的多重共线性、光谱重叠和组分的相互干扰等问题,并且不需分离可直接同时测定混合体系的各组分。因此发展了如主成分回归(PCR)、小波包变换、人工神经网络(ANN)以及遗传算法等多种线性或非线性的多元校准方法,波长选择是光谱分析中各种多元校准方法的关键步骤。

分光光度技术的基本应用定性鉴定用紫外光谱鉴定化合物

使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。分光光度技术的基本应用一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线一样时，则很可能它们是同一物质。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。分光光度技术的基本应用结构分析作为结构分析，紫外吸收光谱远不及红外吸收光谱重要可靠，因为紫外吸收光谱曲线的特征性不及红外光谱曲线，红外光谱曲线属‘指纹’型，而大多数有机化合物在紫外光区无吸收。利用紫外吸收光谱可鉴定化合物中具有共轭系统和芳环结构。分光光度技术的基本应用在生化分析领域主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。分光光度计的误差浓度过高或过低的样品，易引起检测器标尺上的读数误差。从理论上推算，相对误差最小的部分在透光度为36.8%处（或吸光度为0.4343处），故通常认为测定值在吸光度0.20-0.80范围内（透光度为20%—65%）误差最小，超出此范围，相对误差均会增大。分光光度计的误差影响分光光度计精确度的主要原因还有光谱纯度。一般应保持光谱带宽度在10nm以下，如果测定样品中有很狭窄的吸收峰，就必须有更小的光谱宽度，所以分光光度计均有可调的狭缝。在实际应用中，用较大的狭缝虽然可提高重现性，但加大光谱宽度反而减低了准确度。原则为：在保证测定的情况下，应用较低的狭缝分光光度计的误差散射光也是引起误差的重要因素。散射光指一切未经过测定溶液吸收，而又落到检测器上引起干扰的光，如室内自然光，也包括能透过比色皿的非测定需要的其它波长的光。

散射光干扰对高浓度测定特别有害，能使吸光度降低，标准曲线的高浓部分向下弯曲。

使用原则：分光光度计宜安装在光线较暗的室内。

荧光分析法光致发光：物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的波长更长的光，这种现象称为光致发光。荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。我们通常所说的荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等

荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。特点：1）灵敏度高2）选择性好3）方法简单快速，用样量少4）应用受限荧光分析法的基本原理一、分子荧光（一）分子荧光的产生（二）荧光的激发光谱和发射光谱二、荧光与分子结构三、影响荧光强度的外部因素

一、分子荧光（一）分子荧光的产生1、分子的电子能级与激发过程

基态+hv→激发态光谱中电子能级可分为二组：1）电子自旋配对的（电子自旋方向相反，电子的净自旋S=0，谱线多重性M=2S+1=1）称为单重态或单线态，以S表示。2）电子自旋非配对的（电子自旋方向相同，其净自旋S=1，谱线多重性M=3）称为三重态或三线态，以T表示。

激发单重态与相应的三重态的区别在于电子自旋方向不同及三重态的能级稍低一些。三重态寿命较长。2、荧光的产生基态光辐射激发态基态释放能量振动弛豫（vibrational

relexation）处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞，能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振动能级。

特点：无辐射跃迁；只能在同一电子能级内进行；时间约为10-12s；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。内部能量转换（internalconversion）：内转换两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

特点：无辐射跃迁；两个电子激发态具有相同的多重性（都是单重态或都是三重态，如S2*→S1*，T2*→T1*）。处于激发单重态的分子通过振动弛豫和内转换，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级。

荧光发射处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量子称为荧光。

特点：

1）发射光量子，且荧光波长总是长于激发光波长；

2）时间约为10-9-10-7s；

3）荧光谱线有时呈现几个非常接近的峰（电子返回到基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）；

4）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基态最低振动能级。（二）荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱（excitationspectrum）：不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制：固定发射波长，荧光强度（F）对激发波长（λex）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。荧光光谱（fluorescencespectrum）：在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（F）对发射波长（λem）的关系曲线。荧光分析法通常采用λexmax与λemmax。（二）有机化合物分子结构与荧光的关系能够发射荧光的物质同时具备两个条件：

1）有强的紫外-可见吸收

2）有一定的荧光效率

长共轭分子→较强紫外吸收

刚性平面结构分子→较高荧光效率{1、长共轭结构具有π→π*跃迁大多数产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，π电子共轭程度越大，荧光强度越大，荧光波长也长移。2、分子的刚性-共平面性分子刚性-共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。3、取代基

1）给电子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等，能增加分子的π电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光波长长移。

2）吸电子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，减弱分子的π电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。

3）取代基对π电子共轭体系作用较小，如-R、-SO3H、-NH3+等，对荧光影响也不明显。荧光探针分子的几个基本要求

（1）能产生稳定的，较强的荧光。（2）探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固。（3）探针的荧光必须对环境条件较敏感。（4）结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。（三）荧光试剂弱/无荧光物质+荧光试剂→强荧光产物1、荧光胺（fluorescamine）：特点：与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物。荧光胺及其水解产物均不显荧光。荧光条件：λex=275/390nm，λem=480nm。

2、邻苯二甲醛（OPA）：特点：在2-巯基乙醇存在下，pH9-10的缓冲溶液中能与伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的α-氨基酸生成灵敏的荧光产物。荧光条件：λex=340nm，λem=455nm。例：测定磺胺类药物3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，DANS-Cl，丹酰氯）：

与伯、仲胺及酚基的生物碱反应生成荧光物质。丹酰肼（Dansyl-NHNH2）：与可的松等的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件：λex=365nm，λem=500nm。←含胺基药物的测定雌激素的测定→4、测定无机离子的荧光试剂无机离子+有机化合物→配合物→直接测定荧光强度加入无机离子（如CN-、F-等）配合物荧光减弱或消失荧光猝灭法三、影响荧光强度的外部因素1、温度：温度↑→荧光效率↓，荧光强度↓原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。2、溶剂：

1）溶剂极性：极性↑→荧光波长↑，荧光强度↑原因：极性溶剂中，π→π*跃迁能量差ΔE小，使紫外吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增强。

2）溶剂粘度：粘度↓→荧光强度↓原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃迁增加，使荧光减弱。温度↑→溶剂粘度↓→荧光强度↓3、酸度：荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度也有差异。如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧光；pH<2或pH>13的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。

4、荧光熄灭剂：荧光熄灭：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。作用机制：

1）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；

2）荧光物质分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；

3）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进体系间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态；

4）浓度较大（超过1g/L）时，发生自熄灭现象。荧光熄灭法（fluorescencequenchingmethod）：荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量的方法。荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系溶液的荧光强度在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。在较浓的溶液中，荧光强度并不随溶液浓度呈正比增长。因此，必须找出与荧光强度呈线性的浓度范围。

荧光物质浓度过大时，常常发生猝灭现象。这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。对浓度猝灭产生的原因，最简单的解释是：激发态分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自猝灭。浓度过高，还可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。

条件：极稀溶液

二、定量分析方法1、校正曲线法：以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标。2、比例法：在线性范围内，测定标样和试样荧光强度，对比。3、联立方程式法：用于多组分混合物的荧光分析。

荧光分光光度计

和荧光分析新技术一、荧光分光光度计滤光片荧光计：激发滤光片让激发光通过；发射滤光片常用截止滤光片，截去所有的激发光和散射光，只允许试样的荧光通过，不能测定光谱，只用于定量分析。滤光片-单色器荧光计：将发射滤光片用光栅代替，不能测定激发光谱，可测定荧光光谱。荧光分光光度计：两个滤光片都用光栅取代，可绘制激发光谱和荧光光谱。1、荧光分光光度计的主要部件：激发光源：氙灯、高压汞灯、激光激发单色器（样品池前）：光栅或滤光片发射单色器（样品池后）：光栅或滤光片样品池：石英检测系统：光电倍增管2、仪器的校正（1）灵敏度校正：用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。（2）波长校正：用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。（3）激发光谱和荧光光谱的校正二、荧光分析新技术简介1、激光荧光分析光源：激光，单色性极好，强度更大。优点：提高了荧光分析法的灵敏度和选择性。2、时间分辨荧光分析：利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，以实现分别检测的目的。光源：脉冲激光。应用：多用于临床检验，如乙肝病毒的检测，甲状腺功能检测等。测定水中痕量钍的荧光时间分辨图利用时间分辨荧光法消除铝、锆等的干扰从图中可见，在12s内测定荧光信号，可基本消除铝、锆的影响。

3、同步荧光分析（synchronousfluorometry）

原理：在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值Δλ（通常选用λexmax与λemmax之差），同时扫描发射波长和激发波长，得到同步荧光光谱。若Δλ值相当于或大于斯托克斯位移，就能获得尖而窄的同步荧光峰。荧光物质浓度与同步荧光峰峰高呈线性关系，可用于定量分析。

优点：谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。

同步光谱4、胶束增敏荧光分析

胶束溶液即浓度在临界浓度以上的表面活性剂溶液，极性溶剂中，形成亲水基向外、疏水基向内的胶束。优点：

1）极性较小而难溶于水的荧光物质在胶束溶液中溶解显著增加；

2）胶束溶液对荧光物质有增敏和增稳作用。荧光分析在生物学中的应用

（一）天然荧光物质的应用生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轭双键的系统。如芳香氨基酸、核黄素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。对于含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。1.蛋白质的内源荧光利用蛋白质的内源荧光检测蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法。蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它们的相对荧光强度为100:9:0.5。检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围在300-350（蛋白溶液为中性时）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸(称为A类蛋白质)，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。对于含有色氨酸的蛋白(称为B类蛋白质)，荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧