第四章 荧光分析法

仪器分析第四章荧光分析法学习目的

通过学习荧光分析法的基本原理、荧光分光光度计构造及荧光分析的新技术等内容，达到熟悉荧光分析法在药物分析中应用的目的。学习要点

激发光谱、荧光光谱；产生荧光的条件；荧光强度的影响因素；荧光法分析条件的选择；荧光法的定量依据及适用条件。目录第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光分光光度计第三节荧光分析法分析条件的选择第四节荧光分析法的应用一、荧光发现16世纪人们观察到当用紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质就会发出不同强度和不同颜色的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。

直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念。概述二、分子发光的类型1、按激发的模式分类：2、按分子激发态的类型分类：

分子发光光致发光化学发光热致发光场致发光分子发光荧光磷光三、荧光分析法的特点1、灵敏度高2、选择性强3、工作曲线线性范围宽一、分子荧光的产生二、激发光谱与荧光光谱三、荧光与分子结构的关系四、影响荧光强度的外部因素第一节荧光分析法的基本原理

（一）分子中电子能级的多重性（二）荧光的产生1、振动弛豫2、内部能量转换3、荧光发射4、外部能量转换5、体系间跨越6、磷光发射一、分子荧光的产生电子的多重态是一种电子的运动状态，用M=2s+1表示，s为各电子自旋量子数的代数和其值为0或1。

若分子中所有电子都是自旋配对的，则s=0，M=1，该分子处于单重态，用S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。（一）分子中电子能级的多重性电子激发态的多重态

M=2S+1基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，仍然是M=1，分子处于激发的多重态，用S*表示。若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的变化，分子中便具有两个自旋不配对的电子，s=1，M=3，分子处于激发的三重态，用T1*表示。S*与T1*的区别在于电子自旋方向不同，T1*能级较S*稍低一些。（一）分子中电子能级的多重性电子激发态的多重态

M=2S+1S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式释放多余能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。（二）荧光的产生传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2

的荧光。2、磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）。

S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生3、振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。4、内转换：同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交换的过程。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。S2*S1*S0T1*吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2*内转换振动弛豫（二）荧光的产生（一）激发光谱与荧光光谱（二）荧光光谱特征

二、激发光谱与荧光光谱荧光强度：指发射荧光的光的强度。荧光强度F与荧光物质浓度c，激发光强度I0的关系为F=φfI0(1-10-εbc)其中φf为荧光量子产率，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度。该式表明荧光强度与量子产率成正比，但与荧光物质浓度没有直线关系。稀溶液时，上式简化为

F=2.3φfI0εbc=Kc此时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。（一）激发光谱与荧光光谱1、激发光谱曲线（F−λex曲线）固定荧光的发射波长(即测定波长),改变入射光波长,得到荧光(磷光)强度与入射光波长的关系曲线。

2、荧光光谱（F−λem曲线）固定激发光波长(入射光波长),改变荧光的测定波长(发射波长),得到荧光强度与发射光波长关系曲线。（一）激发光谱与荧光光谱

硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）1、Stokes位移指相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，由于振动弛豫等原因消耗了能量。（二）荧光光谱特征

2、荧光光谱的形状与激发波长无关一般情况下，用不同波长的激发光来激发荧光分子，得到的荧光发射光谱的形状基本相同。原因：荧光均由第一激发态的最低振动能级返回基态产生的。不同激发波长下维生素B2荧光光谱图

（二）荧光光谱特征

3、荧光光谱与激发光谱成镜像关系激发光谱与荧光光谱形状相似，存在“镜像对称”关系。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱（二）荧光光谱特征

室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱

（二）荧光光谱特征

（一）荧光效率（二）荧光寿命（三）分子结构与荧光的关系

三、荧光与分子结构的关系荧光效率也叫荧光量子产率,指物质发射荧光的量子数与所吸收的激发光量子数的比值，用φf表示：荧光素钠在水中φf=0.92；在乙醇中蒽φf=0.30、菲φf=0.10。荧光效率低的物质，虽有强紫外吸收，但没有荧光发射。化合物f0.110.290.460.600.52（一）荧光效率指除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用τf表示。F0为激发时的荧光强度，Ft为激发后时间t的荧光强度，以ln(F0/Ft)对t作直线，直线的斜率即为1/τf。（二）荧光寿命分子产生荧光必须具备的条件：（1）强的紫外-可见吸收；（2）具有一定的荧光量子产率。

分子结构对荧光起决定作用。1、共轭结构2、分子的刚性平面结构3、取代基效应（三）分子结构与荧光的关系1、共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽λex(max)(nm)205286365λem(max)

(nm)278321404F0.110.290.46（三）分子结构与荧光的关系

2、刚性平面结构荧光物质的刚性和平面性增加，荧光效率越大，荧光波长发生长移。芴联二苯F=1.0F=0.2红色荧光弱荧光（三）分子结构与荧光的关系Mg2+萘维生素A8-羟基喹啉3、取代基效应（1）给电子取代基加强荧光如：—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN（2）吸电子取代基减弱荧光

如：—C=O，—COOH，—NO2（3）与电子共轭体系作用较小的取代基，对荧光影响不明显。如：—SO3H，—NH3+

，—R（三）分子结构与荧光的关系（一）溶剂的影响（二）温度的影响（三）pH值的影响（四）散射光的影响（五）荧光熄灭剂的影响四、影响荧光强度的外部因素1、溶剂的极性：对许多共轭芳族化合物，激发时发生了

→*跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂极性的增大，激发态比基态能量下降的更多，荧光光谱向长波移动。2、氢键溶剂形成氢键的能力增大，荧光光谱向短波移动。3、溶剂黏度介质黏度的提高，将减小激发态分子振动和转动的速率，同时降低与其他溶质分子的碰撞概率，有利于提高荧光或磷光的强度。（一）溶剂的影响温度上升，将使激发态分子的振动驰豫和内转化作用加剧，同时增大了发光分子与溶剂分子碰撞失活的机会，将导致溶液荧光和磷光效率和强度下降。荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，每降低10℃，φf增加3%，在-80℃时，φf为1。（二）温度的影响对酸碱型荧光物质，在不同的溶液pH下，荧光物质的存在形式不同，因而具有不同的荧光。（三）pH值的影响散射光分为瑞利光和拉曼光。瑞利光：指光子和物质分子相碰撞时，不发生能量的交换，光子的频率并未改变，只是光子运动方向发生改变的散射光。拉曼光：指光子和物质分子相碰撞时，有部分光子和物质分子发生非弹性碰撞，在光子运动方向发生改变同时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量的交换，光子频率发生改变的散射光。（四）色散光的影响散射光对荧光测定有干扰，选择适当的激发波长可消除。（四）色散光的影响1、荧光熄灭（荧光淬灭）指荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。2、荧光熄灭剂指能与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。3、荧光熄灭类型(1)碰撞淬灭；(2)生成化合物的淬灭(静态淬灭)；(3)能量转移淬灭；(4)氧的淬灭；(5)转入三重态的淬灭；(6)浓度过大引起的自淬灭。（五）荧光熄灭剂的影响一、荧光分光光度计（一）光源（二）单色器（三）样品池（四）检测器（五）信号显示记录器二、荧光分析新技术简介（一）同步荧光分析法（二）三维荧光分析法（三）时间分辨荧光分析法第二节荧光分光光度计一、荧光分光光度计光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器（一）光源氙灯，发射强度大，250nm~700nm范围内的连续光谱，300~400nm波段内的谱线强度几乎相等。（二）单色器两个光栅单色器。激发单色器置于样品池前，用于选择激发光的波长；发射单色器置于样品池和检测器间，用于选择荧光发射波长，并消除其他杂散光的干扰。一、荧光分光光度计（三）样品池通常用低荧光的石英材料制成，四面均为磨光透明面，厚度1cm。问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么异同？（1）样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样。（2）吸收池的形状：紫外-可见分光光度计吸收池两面透光，荧光分光光度计样品池四面透光。（3）

使用注意事项：波长范围、容易破碎、沾污问题。一、荧光分光光度计（四）检测器光电倍增管，电感耦合器件（CCD）。放大倍数：2n~5n（n=10），103~107，最大108~109（五）信号显示记录器计算机光谱工作站，对数字信号进行采集、处理、显示，并对各系统进行自动控制。一、荧光分光光度计（一）同步荧光分析法（二）三维荧光分析法（三）时间分辨荧光分析法二、荧光分析新技术该法同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长构成光谱图。有如下方式：①固定波长差同步扫描法。②固定能量差同步扫描法。③可变波长（可变角）同步扫描法。（一）同步荧光分析法①固定波长差同步扫描法。3种芬芳族化合物p-terphenyl、anthracene和perylene混合。在一个固定的激发光下，发射光扫描(蓝色曲线)不能显示混合物中的组成。20nm间隔的同步扫描(黑色曲线)在3种物质各自发射光值最大时，显示出3段明显的波峰。（一）同步荧光分析法②固定能量差同步扫描法。③可变波长（可变角）同步扫描法。（一）同步荧光分析法特点：简化谱图，减小了谱图重复现象和散射光的影响，提高选择性；但损失了其它光谱带，提供的信息量减少。适合多组分混合物的分析，可应用于不同基因的分型、正常细胞与肿瘤细胞的区分等。（一）同步荧光分析法该法描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化关系的谱图，能提供比常规荧光光谱和倒数荧光光谱更完整的光谱信息。可用于某些癌细胞的荧光代谢物的检测，以区分癌细胞与非癌细胞。（二）三维荧光分析法利用稀土配合物具有长寿命荧光，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的延迟时间(delaytime)，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信号进行测定。该法以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，可标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞。（三）时间分辨荧光分析法镧系金属离子螯合物的荧光寿命（微秒级）较长，通过时间分辨方式可以区别于传统短荧光寿命的背景荧光（纳秒级），可完全消除背景荧光的干扰。镧系金属离子螯合物的荧光很宽的Stoke位移（200nm以上）使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，可提高方法学的稳定性。镧系金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰（半峰宽10~15

nm）使其荧光检测具有很高的效率，提高了检测的特异性和灵敏性。（三）时间分辨荧光分析法第三节荧光分析法分析条件的选择

一、激发波长与荧光波长的选择二、空白溶液的选择三、荧光强度与浓度的关系四、定量分析方法的选择一、激发波长与荧光波长的选择1、查阅文献，了解其是否产生荧光；2、扫描其紫外-可见吸收光谱，找到最大吸收波长；3、在最大吸收波长进行荧光激发，测定其发射光谱，找到荧光发射最大的波长；4、以发射最大波长作为发射波长，测定激发光谱，找到最大激发波长。5、选择在最大激发波长和最大发射波长处进行物质测定。二、空白溶液的选择1、溶剂空白用溶剂做空白溶液，简称溶剂空白。2、试剂空白按照与显色反应相同的条件（不加样品），同时加入各种试剂和溶剂作为空白溶液，称为试剂空白。3、平行操作空白用不含待测组分的样品，按照与样品分析相同的条件与样品平行操作，称为平行操作空白。F=2.3φfI0εbc=Kc

F=2.303K'I0Elc=KcEL=V·hvF为荧光强度，I0为入射光强度，I为通过厚度为l的介质后的光强度，K‘为常数（取决于荧光效率φf和检测系统灵敏度）。在低浓度时，荧光强度与物质浓度成正比关系。在高浓度时，由于淬灭和自吸等原因使荧光强度和浓度之间不成线性关系。三、荧光强度与浓度的关系（一）单组分的荧光测定

1、直接测定法2、间接测定法（二）多组分混合物的荧光分析

1、不干扰，当单组分处理

2、有干扰，可选择不同激发波长测定四、定量分析方法的选择1、直接测定法通过测定被分析物的荧光强度来确定其浓度。2、间接测定法（1）通过化学反应使无荧光物质转变为适合测定的荧光物质；（2）通过荧光熄灭法测定荧光熄灭剂的浓度。如过渡金属离子与具有荧光性质的芳香族配位体络合后，可使配位体荧光熄灭，从而间接测定金属离子。（一）单组分的荧光测定1、当混合物中各个组分的荧光峰不重叠，彼此干扰很小时，可分别性质在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度。2、当混合物中各个组分的荧光峰彼此重叠时，若其激发光谱有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。（二）多组分混合物的荧光分析3、在选择激发波长和发射波长后仍无法分别测定混合物中的各组分时，可尝试同步荧光测定、导数荧光测定等方法。（二）多组分混合物的荧光分析1、原理该法利用衍生的方法将自身不发荧光的分析物，转变为发荧光的化合物，通过测定该化合物的荧光强度间接测定分析物。2、分类可分为化学衍生法、电化学衍生法、光化学衍生法。五、荧光衍生法3、衍生化试剂需满足以下条件：（1）能在缓和条件下与被测物质快速定量反应；（2）生成的荧光衍生物应有良好稳定性；（3）若需经过色谱过程进行分离，则色谱分离后衍生化试剂本身应无荧光。五、荧光衍生法4、常用衍生化试剂（1）荧光胺能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物。荧光胺及其水解物不显荧光。荧光条件：ex=275、390nm，em=480nm。五、荧光衍生法（2）丹磺酰氯[5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯]用于测定胺、蛋白质、多肽N-端氨基酸。可与脂肪族或芳香族伯胺类反应生成磺胺，产生蓝色或蓝绿色荧光。可与肽的N-端氨基酸反应，生成丹磺酰-肽，水解得到有强烈荧光的丹磺酰-氨基酸，用于蛋白质测序和氨基酸测序。荧光条件：ex=350nm，em=500nm。五、荧光衍生法第四节荧光分析法的应用一、定性分析二、定量分析三、应用与示例

一、定性分析荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的手段，用以鉴定化合物。根据试样图谱、荧光峰波长，与标准品进行比较。

一、定性分析荧光激发光谱和荧光光谱可作为定性分析的手段，用以鉴定化合物。根据试样图谱、荧光峰波长，与标准品进行比较。二、定量分析1、标准曲线法常采用标准溶液系列中的某一溶液作为基准，先将空白溶液的荧光强度调至0，再将该标准溶液的荧光强度调至100或50，然后测定系列标准溶液的荧光强度，绘制标准曲线，计算回归方程。再在同样条件下测定试样的荧光强度，利用回归方程求出试样的含量。FCsFxCx二、定量分析为使不同时间绘制的标准曲线前后一致，每次绘制标准曲线时，均可采用统一标准物质进行校正。如果试样溶液在紫外光照射下不稳定，则须改用另一种性质稳定，而且荧光峰形和试样溶液近似的对照品溶液作为基准。二、定量分析如测定维生素B1时，采用硫酸奎宁的0.05mol/LH2SO4溶液作为基准（校正仪器）。黄绿色荧光（维生素B2）可用荧光素钠的水溶液为基准。红色荧光可用罗丹明B水溶液为基准。二、定量分析2、比例法如果标准曲线过零点，可用比例法测定。配制一标准溶液，使其浓度在线性范围内，测定荧光强度Fs，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx。由标准溶液的浓度Cs按下式可求得试样中荧光物质的浓度Cx或含量。若空白溶液的荧光强度调不到0，则Fs及Fx值要扣除空白溶液的荧光强度F0后，按下式计算。对照品和样品溶液的浓度要尽可能接近，以减小误差。（一）无机化合物的荧光分析（二）合成药物的荧光分析（三）中药的荧光分析三、应用与示例1、直接荧光测定法待测元素与有机溶剂组成能发荧光的配合物，通过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。常用该法进行测定的元素有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素。（一）无机化合物的荧光分析2、荧光熄灭测定法某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的的含强度测定此该元素量。如