实验三简单染色法

实验三简单染色法第一页，共二十九页，2022年，8月28日目的要求学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。初步认识细菌的形态特征。学习显微镜（油镜）的使用方法，熟悉无菌操作技术。第二页，共二十九页，2022年，8月28日简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。第三页，共二十九页，2022年，8月28日在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。微生物染色原理第四页，共二十九页，2022年，8月28日材料菌种金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌染色剂仪器或其他用具：显微镜酒精灯载玻片接种环香柏油二甲苯擦镜纸生理盐水等。第五页，共二十九页，2022年，8月28日涂片干燥固定染色水洗镜检简单染色方法干燥第六页，共二十九页，2022年，8月28日作业实验报告（结果部分：绘图说明金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的形态特征，注明观察时使用的物镜及放大倍数）下一个实验：革兰氏染色法第七页，共二十九页，2022年，8月28日1、涂片取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水；用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔；将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。第八页，共二十九页，2022年，8月28日第九页，共二十九页，2022年，8月28日2、干燥将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。第十页，共二十九页，2022年，8月28日3、固定手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。第十一页，共二十九页，2022年，8月28日4、染色将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min草酸铵结晶紫染色约1min。第十二页，共二十九页，2022年，8月28日5、水洗将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。第十三页，共二十九页，2022年，8月28日6、干燥自然干燥：平放于室温，自然干燥；吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。第十四页，共二十九页，2022年，8月28日7、镜检涂片干后镜检。防止水的折射，以便于观察。第十五页，共二十九页，2022年，8月28日显微镜的基本结构（P41）1.物镜转换器2.物镜3.标本夹4.载物台5.聚光器6.彩虹光圈7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋（粗调节器）12.微调螺旋（细调节器）13.镜臂14.镜筒15.目镜16.玻片夹推进器第十六页，共二十九页，2022年，8月28日显微镜使用操作步骤1、观察前的准备2、显微镜观察3、显微镜使用完毕后的处理第十七页，共二十九页，2022年，8月28日1、观察前的准备仔细阅读显微镜使用说明书取镜（一手握镜臂，一手托底座）显微镜的放置（平放，距边缘约10cm）熟悉显微镜，检查显微镜调节光源（光线均匀，亮度适宜）调节双筒显微镜的目镜调节聚光器数值孔径检查显微镜物镜、目镜、聚光器第十八页，共二十九页，2022年，8月28日2、显微观察观察程序如下：放置观察标本低倍镜观察高倍镜观察油镜观察第十九页，共二十九页，2022年，8月28日将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处于物镜的正下方。放置观察标本第二十页，共二十九页，2022年，8月28日下降低倍物镜，从侧面注视调节，使其接近标本。双眼看目镜，慢慢旋转粗调节螺旋使镜筒缓慢升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位，置于视野中心，观察、记录结果，并准备换高倍镜观察。低倍镜观察第二十一页，共二十九页，2022年，8月28日将高倍物镜转至镜筒下方(在转换物镜时，要从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞)。调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，移动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。

高倍镜观察物镜的同焦现象（P44）第二十二页，共二十九页，2022年，8月28日用粗调螺旋将镜筒上升，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心下降镜筒，使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止(注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。调节聚光器及照明后，眼看目镜，微微转动粗调螺旋将镜筒上升，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。油镜观察第二十三页，共二十九页，2022年，8月28日油镜的工作原理（P42）1、增加照明亮度2、增加显微镜的分辨率第二十四页，共二十九页，2022年，8月28日1、增加照明亮度使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系。第二十五页，共二十九页，2022年，8月28日一些物质的折射率：水1.33

玻璃1.52

空气1.0

香柏油1.515第二十六页，共二十九页，2022年，8月28日2、增加显微镜的分辨率分辨率（分辨力）是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。式中=光波波长数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：其中第二十七页，共二十九页，2022年，8月28日香柏油的折射率大于空气和水，因此，它作介质时，数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小，即分辨率越高。

第二十八页，共二十九页，2022年，8月28日观察