实验九质粒的制备和酶切

实验九质粒的制备和酶切第一页，共三十四页，2022年，8月28日1、质粒DNA的提取第二页，共三十四页，2022年，8月28日一．实验目的及背景

质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。第三页，共三十四页，2022年，8月28日质粒特点质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。第四页，共三十四页，2022年，8月28日质粒类型质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和

严紧型质粒1.松弛型质粒松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。第五页，共三十四页，2022年，8月28日2.严紧型质粒严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。第六页，共三十四页，2022年，8月28日质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。第七页，共三十四页，2022年，8月28日本实验目的本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。第八页，共三十四页，2022年，8月28日分离质粒DNA方法从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的碱变性法；煮沸法；SDS法；羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。第九页，共三十四页，2022年，8月28日碱变性法基本原理在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。第十页，共三十四页，2022年，8月28日

实验试剂

ＬＢ培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：

0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鲜配制）第十一页，共三十四页，2022年，8月28日试剂溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase琼脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA第十二页，共三十四页，2022年，8月28日EnzymeswhichcutpBluescriptIIKS(+)DNAonce:

Acc65I755,AdeI222,AflIII1153,AloI169,ApaI749,BamHI689,BcgI2562,BcuI683,BsaAI225,Bsp120I749,BstXI658,Bsu15I725,BtgI661,

CaiI1564,Cfr9I695,Cfr42I661,Eam1105I2041,Ecl136II653,Eco31I2113,Eco32I713,Eco52I670,EcoO109I748,EcoRI707,FaqI

457,

GsuI2131,Hin1I2582,HincII734,HindIII719,KpnI755,NotI669,OliI659,PdiI328,PdmI2641,PscI1153,PsiI97,PstI701,SacI653,SalI734,SapI1030,ScaI2524,SmaI695,TatI2524,XbaI677,XceI1153,XhoI740,XmiI734.第十三页，共三十四页，2022年，8月28日三．实验方法

１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5mlLB培养液中（含AmP50μg/ml），３７℃强烈摇荡过夜。２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟。４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容物，冰上放置5分钟。５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。６．12000g4℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。第十四页，共三十四页，2022年，8月28日５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。

６．12000g4℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中。(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g4℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。)８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。９．１２０００g,4℃离心５分钟。１０．弃上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000g于4℃离心２分钟。１１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交给助教加RNA酶，之后37℃10分钟。第十五页，共三十四页，2022年，8月28日１２．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA,然后交给助教加RNA酶，之后37℃10分钟。13．取2μlDNA溶解液用ＴＥ稀释至200ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD280之比；14.同时以以下公式计算得率。质粒DNA得率：稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml15．做酶切之后剩余的质粒全部上交用来电泳,电泳0.5小时,电压200伏。16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。第十六页，共三十四页，2022年，8月28日四．结果分析１．质粒DNAOD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。２．记录电泳结果并说明结果内容。第十七页，共三十四页，2022年，8月28日问题与讨论：

１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。3.沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？第十八页，共三十四页，2022年，8月28日2、ＤＮＡ的酶切

第十九页，共三十四页，2022年，8月28日一．实验目的及背景

核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。第二十页，共三十四页，2022年，8月28日限制酶的类型根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。第二十一页，共三十四页，2022年，8月28日Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。第二十二页，共三十四页，2022年，8月28日酶切反应中应注意以下几个问题：１．内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ugDNA对２－３u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。第二十三页，共三十四页，2022年，8月28日２．ＤＮＡ：作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ugDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。第二十四页，共三十四页，2022年，8月28日３．反应缓冲液：反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在之间；NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。第二十五页，共三十四页，2022年，8月28日４．酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１２小时即可，充分酶解。第二十六页，共三十四页，2022年，8月28日二、实验试剂

限制性内切酶ＤＮＡ（λＤＮＡ和质粒ＤＮＡ）１０×buffer:50mMTrisHClpH7.5100mMNaCl10mMMgCl2无菌水第二十七页，共三十四页，2022年，8月28日三．实验方法

１．按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA１μg10×buffer2.5μl无菌水内切酶2μ总体积：25μl第二十八页，共三十四页，2022年，8月28日

２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。３．Eppendorf管封上封口膜于３７℃水管中反应２小时。４．反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。５．取１０μl反应液加２μlLoadingbuffer混匀于１％琼脂糖凝胶上４０伏电泳２－３小时。６．紫外透射仪上检查实验结果。第二十九页，共三十四页，2022年，8月28日四．结果与分析

１．记录紫外透射仪上观察到的结果。２．分析实验结果的成因。问题与讨论：１．在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？２．如何选择ＤＮＡ和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的１０％？第三十页，共三十四页，2022年，8月28日RestrictionEndonucleases:

AnOverviewRestrictionenzymeswerediscoveredabout30yearsagoduringinvestigationsintothephenomenonofhost-specificrestrictionandmodificationofbacterialviruses.Bacteriainitiallyresistinfectionsbynewviruses,andthis"restriction"ofviralgrowthstemmedfromendonucleaseswithinthecellsthatdestroyforeignDNAmolecules.Amongthefirstofthese"restrictionenzymes"tobepurifiedwereEcoR

IandEcoRIIfromEscherichiacoli,andHindIIandHindIIIfromHaemophilusinfluenzae.TheseenzymeswerefoundtocleaveDNAatspecificsites,generatingdiscrete,gene-sizefragmentsthatcouldbere-joinedinthelaboratory.Researcherswerequicktorecognizethatrestrictionenzymesprovidedthemwitharemarkablenewtoolforinvestigatinggeneorganization,functionandexpression.Astheuseofrestrictionenzymesspreadamongmolecularbiologistsinthelate1970’s,companiessuchasNewEnglandBiolabsbegantosearchformore.Exceptforcertainviruses,restrictionenzymeswerefoundonlywithinprokaryotes.Manythousandsofbacteriaandarchaehavenowbeenscreenedfortheirpresence.Analysisofsequencedprokaryoticgenomesindicatesthattheyarecommon--allfree-livingbacteriaandarchaeaappeartocodeforthem.Restrictionenzymesareexceedinglyvaried;theyrangeinsizefromthediminutivePvuII(157aminoacids)tothegiantCjeI(1250aminoacids)andbeyond.Amongover3,000activitiesthathavebeenpurifiedandcharacterized,morethan250differentsequence-specificitieshavebeendiscovered.Ofthese,over30%werediscoveredandcharacterizedatNewEnglandBiolabs.第三十一页，共三十四页，2022年，8月28日Thesearchfornewspecificitiescontinues,bothbiochemically,bytheanalysisofcell-extracts,andcomputationally,bytheanalysisofsequencedgenomes.Althoughmostactivitiesencounteredtodayturnouttobeduplicates--isoschizomers--ofexistingspecificities,restrictionenzymeswithnewspecificitiesarefoundwithregularity.Beginningintheearly1980’s,NewEnglandBiolabsembarkedonaprogramtocloneandoverexpressthegenesforrestrictionenzymes.Cloningimprovesenzymepuritybyseparatingenzymesfromcontaminatingactivitiespresentinthesamecells.Italsoimprovesenzymeyieldsandgreatlysimplifiespurification,anditprovidesthegenesforsequencingandanalysis,andtheproteinsforx-raycrystallography.Restrictionenzymesprotectbacteriafrominfectionsbyviruses,anditisgenerallyacceptedthatthisistheirroleinnature.Theyfunctionasmicrobialimmunesystems.WhenastrainofE.colilackingarestrictionenzymeisinfectedwithavirus,mostvirusparticlescaninitiateasuccessfulinfection.Whenthesamestraincontainsarestrictionenzyme,however,theprobabilityofsuccessfulinfectionplummets.Thepresenceofadditionalenzymeshasamultiplicativeeffect;acellwithfourorfiveindependentrestrictionenzymescouldbevirtuallyimpregnable.第三十二页，共三十四页，2022年，8月28日

Restrictionenzymesusuallyoccurincombinationwithoneortwomodificationenzymes(DNA-methyltransferases)thatprotectthecell’sownDNAfromcleavagebytherestrictionenzyme.ModificationenzymesrecognizethesameDNAsequenceastherestrictionenzymethattheyaccompany,butinsteadofcleavingthesequence,theymethylateoneofthebasesineachoftheDNAstrands.ThemethylgroupsprotrudeintothemajorgrooveofDNAatthebindingsiteandpreventtherestrictionenzymefromactinguponit.Together,arestrictionenzymeandits"cognate"modificationenzyme(s)formarestriction-modification(R-M)system.InsomeR-Msystemstherestrictionenzymeandthemodificatione