临床输血学检验(技术)：5白细胞抗原系统检测

第四章白细胞抗原检测技术P74临床血液教研室第一节HLA检测技术P781、血清学方法2、细胞学方法3、分子生物学方法HLA检测技术由抗原检测等位基因检测HLA分型技术的应用器官和造血干细胞移植供受者组织相容性配型血小板输注前的配型疾病相关实验性诊断法医鉴定和亲子鉴定等。一、血清学分型方法血清学分型方法是用一系列已知的抗HLA抗原的标准分型血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别。需要HLA抗体作为分型试剂采用微量淋巴细胞毒试验测定HLA-A、B、C位点上的等位基因。1.微量淋巴细胞毒实验P74

1964年，Terasaki建立微量淋巴细胞毒实验仍是目前HLA抗原鉴定的标准方法条件：有活力的T,B淋巴细胞

HLA分型标准血清（大部分是IgG）原理待检淋巴细胞膜表面若具有特异HLA抗原，可与HLA特异性抗体结合形成抗原抗体复合物，在补体介导下发生细胞毒反应而被杀伤。加入适当的染料（如曙红）后，被杀伤的淋巴细胞膜通透性增加，染料进入细胞内，细胞着色；若淋巴细胞不带有HLA抗原，抗原抗体未结合，则细胞膜完整，染料不能使细胞着色。在倒置显微镜下估计着色细胞的百分比来判断抗原、抗体反应的强度。方法评价与注意事项

1．血清学分型技术可以检测HLA-I类抗原，但此技术用于检测HLA-II类抗原难度较大，主要因为：（1）HLA-II类抗原在未激活的T细胞上不表达，需分离纯化B淋巴细胞。（2）HLA-II类抗原多态性由双等位基因构成，很难准确判定相应等位基因产物的抗原特异性。2．HLA标准分型抗血清试剂的质量是试验的关键。（1）HLA抗血清应使用单克隆抗血清。（2）抗体效价要适宜。（3）抗血清种类应覆盖本民族、本地区80%以上的HLA抗原。3.淋巴细胞：高活性，纯度应大于90%4.试验应在20～25℃的室温条件下进行，才能获得最佳的反应效果。5.补体来源一般采用多只健康家兔血清混合。由于兔补体（兔血清）中无天然细胞毒抗体，不会引起假阳性反应。6．加入染料之后须加入甲醛，甲醛固定能使活细胞具有更大的折光性，易于与死细胞区别。7．每块反应板应设立阴性对照（阴性对照血清一般采有AB型男性、无受血史者血清）和阳性对照（阳性对照孔中加入抗人淋巴细胞球蛋白），在阴性对照结果为阴性、阳性对照结果为阳性反应时，判读结果才可靠。8．HLA血清学分型技术虽经典，但存在标本血淋巴细胞高活力和纯度难以保证，HLA抗血清试剂存在交叉反应、弱反应及额外反应等众多因素，导致HLA血清学分型错误率较高，目前血清学方法已逐渐被基因分型技术所取代。二、HLA细胞学分型技术P77对HLA-D抗原特异性进行分型，曾利用该技术鉴定了多个HLA-D、HLA-DP抗原。但由于该分型技术细胞来源困难、操作繁琐、试验流程长，不适合常规检测，而且该方法指定抗原偏差较大，故该分型技术已逐渐被淘汰。三、HLA的基因分型技术自1996年，以DNA为基础的HLA的基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞学方法。成为最准确的分型技术。HLA基因分型检测是检测个体HLA座位上的等位基因序列情况HLA血清学技术和细胞分型技术是检测HLA座位上的抗原情况特点：精确，可靠，重复性好。歧义结果低分辨分型：*后第2位（抗原分解物水平分型）高分辨分型：*后第4－8位（等位基因水平分型）HLA的基因分型方法的种类1、基于HLA基因序列不同为基础;2、基于HLA等位基因在PAGE中不同的构象而设计。1.基于HLA基因序列不同为基础

PCR-SBT（PCR-直接测序分型）PCR-SSO（PCR序列特异性寡核苷酸探针）PCR-RFLP（PCR限制性片段长度多态性）PCR-SSP（PCR序列特异性引物）基因芯片技术Qiagen/OlerupSSP低分辨试剂

Qiagen/OlerupSSP高分辨试剂采用美国OneLambda公司PCR-SSP

ABDRDQ配型试剂盒肾移植供受者双方进行HLA基因分型Qiagen/OlerupSBT测序分型试剂

2.基于HLA等位基因在PAGE中不同构象而设计PCR指纹技术PCR-SSCP：PCR单链构象多态性RSCA：参比链介导的构象分析HLA分子生物学检测方法评价

HLA基因分型法与血清学及细胞学分型方法比较，具有分辨率高、错误率少、样本需要量少、样本可长期保存、分型试剂可大量制备且来源不受限制、试验结果精确、可靠、重复性好等优点。HLA高分辨分型中歧义结果

HLA具有极为复杂的多基因性和高度多态性。随着HLA等位基因的增多，同一位点不同等位基因之间的碱基差异序列较少，导致大量等位基因碱基序列高度同源，基因检测时可得到歧义的分型结果，不能明确指定某一基因型，特别是在高分辨率分型时。HLA抗原可引起免疫应答产生HLA抗体。HLA抗体在临床上具有重要意义，可诱发移植的超急性排斥反应、发热性非溶血性输血反应、血小板输注无效等。第二节HLA抗体检测群体反应性抗体（PRA）群体反应性抗体（panelreactiveantibody，PRA）是指器官移植受者体内存在的抗HLA抗体。也可因妊娠、反复输血等而产生，与移植物排斥反应及受者存活率密切相关。PRA测定是筛选各种组织器官移植致敏受者和了解患者术后体内抗体水平简便易行的方法。PRA抗体检测方法1、补体依赖的淋巴细胞毒方法2、ELISA3、流式细胞术1.补体依赖的淋巴细胞毒方法－CDC适用：HLA-I，II类抗体，包括IgG，IgM包括：淋巴细胞毒交叉配合试验

OneLambda细胞板方法特点：灵敏度低，只能检测补体结合的抗体，不能检测非补体依赖的抗体，不能区分HLA特异性抗体和非特异性抗体。肾移植前－群体反应性抗体PRA检测

淋巴细胞毒试验原理：将病人的血清与数十份含不同HLA抗原的淋巴细胞作细胞毒抗体测定来系统了解移植前患者的抗体水平，判断移植的可能性及与供者有阳性交叉的百分比。

结果判断：通常将PRA值分为非致敏（＜10%），轻度致敏（10%-50%），高致敏（＞50%）。

2.ELASA方法特点：更敏感，特异性好，可检测HLA特异性抗体，可检测补体依赖或者非依赖的HLA抗体，可定量。应用：微量ELASA筛选HLA-I，II类抗体3流式细胞术普通流式细胞术免疫磁珠流式细胞仪：基于FCM和免疫标记技术的结合，以微球磁珠为靶细胞。Luminex100/200－液相芯片

Luminex检测技术用于HLA抗体检测原理：以包被抗原的微球作为靶细胞，每种微球包被一种抗原，多种微球可以在同一体系内反应。当加入待检血清与微球在室温下孵育时，若待检血清中存在HLA