感染性疾病的实验诊断

感染性疾病的实验诊断不适当初始抗菌治疗将导致病死率显著提高不充分初始治疗充分初始治疗Apost-antibioticeraisinsteadaveryrealpossibilityforthe21stcentury-----WHO提高抗感染水平的关键

-正确的诊断感染的诊断

感染类型，感染部位病原体的诊断

获得确切的病原体耐药性的诊断

耐药菌的种类耐药机制明确感染性疾病的实验室诊断分子生物学方法显微镜直接镜检分离培养鉴定非培养技术金标准生物标志物病例1患者男性，33岁，有18年乙肝病史6.27患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达38.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心6.30在杭州某医院就诊，血常规：白细胞

7.4×10E9/L，淋巴细胞3.6×10E9/L，超敏CRP

10mg/l，拟诊为“脑炎”，建议患者住院行腰穿，患者拒绝7.1来我院就诊，头颅CT未见异常血培养结果成为诊断的关键7.1血培养：马耳他布鲁菌病例2美平美平+替考美平+替考+米卡芬净特治星+万古+米卡芬净泰能+替加+万古+米卡芬净7.30血培养阴性7.31血培养阴性8.1血培养阴性8.4血培养阴性8.6送检血培养,4.5H报警阳性(下午6点）8.7早上血培养报警阳性，涂片阴性杆菌

立即抽取血培养液离心取菌液上机鉴定药敏下午3点鉴定结果大肠埃希菌下午4点药敏结果IMPMIC≥16ug/ml,TGCMIC0.38ug/ml，其余抗菌药物均耐药。

PCR证实产NDM-1采血指徵

发热（38C）或低温（36C）、寒战、呼吸快白细胞增多（计数大于10，000109/L，特别有“核左移”未成熟的或杆状核）、CRP升高皮肤粘膜出血血压降低、昏迷、多器官衰竭血液病：粒细胞减少（成熟的多核白细胞<1000109/L）、血小板减少血培养遇到的问题血培养阳性率偏低

血培养污染报告时间较长(48–72h)提高血培养阳性率，关键在临床；改善血培养报告质量，关键在实验室影响血培养阳性的关键因素采血时机采血次数接种血液数量皮肤消毒…为什么要采双瓶双侧我院数据每瓶要保证足够的血量JMicrobiolImmunolInfect,2013,46(1):48-52初步染色，转种培养染色报告鉴定/药敏试验血标本阳性报警完整报告血培养三级报告－缩短TAT鉴定第一天第二天第三天显微镜直接镜检2011世界卫生组织(WHO)对临床微生物实验室提出三项指导性方针临床微生物实验室尽可能把目标集中在快速诊断方面显微镜检查对建立快速的初步诊断具有很大价值实验室人员必须主动于临床结合，将实验室数据转化为临床有用的信息快速、准确、可重复性革兰染色痰涂片可见阳性双球菌，疑似肺链病例3患者胡某某，女，52，因“发热半月余，胸痛1周”入院（2013.11.11）简要病史：患者半月前出现发热，最高体温40.0℃，1周前感胸痛，深呼吸及咳嗽时较明显，2天前至当地医院就诊，予抗感染治疗，未见明显好转。既往史有溶血性贫血、高血压病史，长期不规则服用激素2013.11.11肺CT：两肺多发结节灶2013.11.14肺增强CT：两肺多发结节伴厚壁空洞，两侧少量胸腔积液，曲霉菌感染首先考虑，恶性病变待排，必要时穿刺活检痰涂片

（2013.11.13）涂片报告提示奴卡菌11.202014.1

.12.53.5革兰染色可见鬼影细胞抗酸染色墨汁染色阳性率60-70%发病早期病原学检出率低，穿刺部位对检出阳性率也有影响，隐球菌主要集中在脑膜或脑室脉络丛肉芽肿中细胞内工作人员经验肺泡灌洗液

六胺银染色血清学（抗原抗体）检测快速报告结果敏感性高取材简便定量检测可判断感染严重程度及疗效评估乳胶凝集试验：以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附新型隐球菌荚膜多糖抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应胶体金法：新型隐球菌荚膜多糖抗原检测阴性阳性隐球菌脑膜炎中的应用李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度61.1％（11/18),脑脊液真菌培养灵敏度38.9％(7/18),隐球菌抗原检测灵敏度100％(18/18)，特异度99.4%(149/150)刘正印等报道墨汁涂片染色阳性23例(23/26,88%)，乳胶凝集试验抗原阳性20例(20/20，100%)，培养阳性8例(8/13,62%)大多数研究报道灵敏度93–100%，特异性93–98%李娟,吕晓菊,等.四川大学学报（医学版）,2010,41(6):1074-1075,1079刘正印,王爱霞,等.中华内科杂志,2002,41(8):541-543隐球菌脑膜炎（38人）荚膜抗原试验培养墨汁染色脑脊液血清脑脊液脑脊液21/2119/1922/3218/3110068.858.137肺隐球菌病（51人）荚膜抗原试验培养病理39/514/1927/3476.52179.438肺部隐球菌病中的应用G试验G试验检测底物：(1-3)--D-葡聚糖(真菌细胞壁成分>50%)G试验的原理：鲎试验：级联凝固反应G因子亚基亚基(丝氨酸蛋白酶原)(1-3)--D-葡聚糖结合丝氨酸蛋白酶比浊法测定比色法测定激活KędzierskaA,etal.EurJClinMicrobiolInfectDis.2007,26:755.G试验的特点可检测多种致病真菌感染可检测多种致病真菌感染

念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌、毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染阳性结果代表存在侵袭性真菌感染缺点：

不能区分念珠菌和曲霉

肺曲霉球：曲霉呈寄居状态而非侵袭性感染

假阳性高（动态监测，2-3次/周）G试验的影响因素临床方面标本溶血、黄疸和脂肪血；标本中存在葡聚糖酶采集、处理过程中污染疾病某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症），G-杆菌败血症诊疗操作应用纤维素膜进行血液透析患者医疗物品中含有葡聚糖：棉纱布、海绵某些血液制品可能含有葡聚糖白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等药物抗肿瘤类药物（香菇多糖、裂殖菌多糖），磺胺类药物，多粘菌素E，厄他培南，头孢噻肟，头孢吡肟，氨苄西林－舒巴坦，克拉维酸等食物：蘑菇类实验室方面试剂实验条件：理想状态：试验应在无菌、无灰尘、无电流干扰和无震动的环境中进行，建议使用生物安全柜。试验时应尽量避免阳光直接照射，试验环境温度为10-30℃。实验中使用的所有器具和耗材均应符合无菌、无热源要求标本放置时间过长（一般不超过4小时）44ClinicalInfectiousDiseases2005;41:654–945JClinMicrobiol.2013Nov;51(11):3478-83相关指南推荐欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组和美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(EORTC/MSG)共识组欧洲临床微生物与感染性疾病学会(ESCMID):2012念珠菌血症诊断指南2013年美国《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》肺真菌病诊断和治疗专家共识G试验已作为微生物学证据列入IFI的诊断指南阴性预测值高，但不能用G试验结果来做排除性诊断！47JClinMicrobiol.2013Nov;51(11):3478-83动态监测假阴性的因素：马内菲、隐球菌、接合菌、近平滑免疫复合物形成卡泊芬净使用标本放置过长GM试验

检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过程中释放)

标本：血清、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液方法：ELISA双抗体夹心法cut-off值：ODI≥0.5两次ODI≥0.5或一次ODI≥0.7提高阳性预测值Meta分析化疗、血液肿瘤引起的粒缺患者灵敏度58%，特异性95%HSCT患者灵敏度65%，特异性65%实体器官移植患者41%，特异性85%GM假阳性与真菌成分有交叉反应（组织胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀霉、头状地霉等）药物：哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸高剂量使用激素谷类食物中的GM抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患者或肠道GVHD更容易发生这种吸收儿童和新生儿：假阳性83%（母乳或配方食品中双歧杆菌与GM有交叉反应）

GM假阴性预防性和经验性抗真菌治疗抑制了真菌的生长和GM的释放慢性曲霉菌感染病灶局部被纤维组织包裹未侵入血管或GM释放微量GM与GM抗体或血液中的多种物质结合后使其抗原表位被封闭体内产生高滴度GM抗体，抗原抗体结合后被细胞吞噬或被肾脏清除BAL-GM在IPA高风险人群中肺泡GM检测意义1、ODindex>=3的特异性是100%，阳性预测值100%；阳性似然比达到100%2、ODindex0.5敏感性高，<0.5的阴性预测值大，基本可排除曲菌感染。阴性似然比很小，0.07。3、ROC曲线下面积最大，0.8是最佳折点GM试验的临床价值血清GM推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者（未进行抗真菌治疗）早期诊断（可以抢先治疗）实体肿瘤、实体器官移植（SOT）、ICU等非粒缺高危患者，单次血检测GM阳性还需结合影像（肺部CT）等综合考虑，建议同时测定BALFGM半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用（使用卡泊芬净，GM升高）5455G试验和GM试验联合检测的意义-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------种属G试验GM试验----------------------------------------------------------------------------------念珠菌属镰刀菌属隐球菌属曲霉菌属青霉菌/拟青霉接合菌纲++-++

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-/++-/+

------------------------------------------------------------------------------------联合检测WBC白细胞计数Endotoxin内毒素IL-6白介素-6IL-10白介素-10TNF肿瘤坏死因子Procalcitonin降钙素原CRPC反应蛋白ProteinCHMG-1sTREM-1........选择合适生物学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效C反应蛋白C反应蛋白是在机体受到感染或组织损伤时肝脏细胞分泌到血浆中的蛋白质（急性时相反应蛋白），通过激活补体和加强吞噬细胞的吞噬可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断：通常细菌性感染>100mg/L，与感染后6-8h时显著升高，达峰时间为24-48h，其升高水平与感染程度呈正相关。感染消除后急剧下降，一般1周内恢复。病毒感染时水平一般正常或轻度升高PCTMüllerB.etal.,JCEM2001CT降钙素在细菌感染/脓毒血症状态下PCT在各个组织、器官大量形成并释放进入血液循环系统正常情况下细菌内毒素、TNF-a、IL-6等促炎细胞因子降钙素原LinscheidP,etal

CritCareMed04;32:1715-21

Endocrinology03;144:5578-84&05;146:2699-708

在病毒感染时，IFN-(-干扰素)大量产生，将会抑制PCT的激活及产生因此，病毒感染时，PCT的浓度将会保持在较低的水平BacterialInfection

(e.g.Endotoxin)

不同的标志物的动力学变化ReinhartK,etal.CritCareClin2006;22;503-519PCT快速、高特异性的增长

在脓毒症情况下，3-6小时即可检测到其水平的增长快速衰减

半衰期约20-24小时,可以快速反映治疗效果CRP价值

半衰期为19小时CRP值的升高滞后炎症活动变化12小时左右

PCT与其他炎症反应因子PCTIL-6CRPPCT比传统的CRP、IL-6等炎性指标，有着更好的ROC曲线下分析，体现出更具优势的诊断灵敏度和特异性Mülleretal.,CCM2000lactatesMulleretal.,Circulation

2004在传染性心内膜炎的早期诊断上，PCT体现出比CRP更好的诊断灵敏度和特异性1-PCT与真菌感染念珠菌

念珠菌相关的脓毒症在大多数情况下，PCT始终在0.05-2之间起伏曲霉菌

PCT会延迟上升

大多数情况下,PCT浓度前期在0.05-2间起伏，然后会有非常明显的升高，浓度甚至可达几十菌血症念珠菌血症

单一次PCT检测不容易鉴别细菌感染与真菌感染连续监测PCT浓度变化，更容易看出真菌感染时的变化规律非典型病原体感染中的PCT水平病因降钙素原临界点

(ng/mL)评论参考文献侵袭性真菌感染0.5后期增加，在第1-3天,敏感性仅为

53%,高峰期敏感性90%,念珠菌血症较不显著;曲霉菌的峰值延后SuppCareCan.2005;13(5):343-6军团菌0.5(平均

13.5)敏感性86.7%ClinMicrobiolInfect.2009肺结核2(平均

4.16)敏感性30%特异性82%,建议在HIV患者中使用Int

JTubercLung

Dis.2006

支原体0.5(平均

0.2-0.96)敏感性20%,反应严重程度韓晓华中国当代儿科杂志

2007细菌感染严重程度判断

在感染疾病严重程度的发展过程中，PCT随着严重程度的不同（局部感染、脓毒血症、严重脓毒血症、脓毒性休克），呈现由低到高的浓度变化PCT血中浓度与病程发展呈正相关对于感染程度及器官机能障碍的严重性进行准确的判断病例4患者因“发热5天”于2015-10-21入院无高血压、心脏病、糖尿病、慢性肾病，已戒烟、戒酒20年基本信息：患者，性别：男性年龄：69岁病史患者5天前出现发热，最高体温39.5℃，伴咳嗽，无咳痰。外院就诊肺部CT示：右下肺感染性病变、两侧少量胸腔积液。CRP219.24mg/L，白细胞5300，中性粒

92.6%，血沉

86mm/h，白蛋白26.2g/L，谷丙转氨酶86U/L，谷草转氨酶213U/L，肌酐355umol/L，尿素氮20.1mmol/L。诊断考虑“肺炎”，予头孢西丁针、消炎痛栓等治疗，患者胸闷气急加重。肺部CT2015-10-20入科诊断1.社区获得性肺炎，重症2.I型呼吸衰竭3.急性肾功能衰竭病毒？PCT：细菌？CAP：军团菌?军团菌尿抗原快速检测检测到嗜肺军团杆菌血清型1型尿抗原特异性达99％临床应用依据生理生化特征进行鉴定的传统方法面临很多的困难费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率苛养和少见细菌感染增加常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种分子生物学技术在临床的应用基于基因扩增及测序技术的快速鉴定蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定16SrRNA序列测定

已成为疑难病原菌检测和鉴定的常用方法结核病获得结果时间痰或其他标本去污染及液化

沉淀物抗酸杆菌涂片

液体快速培养

固体培养基分枝杆菌菌种鉴定结核分枝杆菌非结核分枝杆菌药