通过向卵母细胞中注入孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因小鼠的传代

通过向卵母细胞中注入孤雄单倍体胚胎干细胞获得转基因小鼠的传代

HuiYang,1,6

LinyuShi,1,6Bang-AnWang,2,6DanLiang,1CuiqingZhong,1WeiLiu,2YongzhanNie,4

JieLiu,4JingZhao,5XiangGao,5

DangshengLi,3

Guo-LiangXu,2,*

andJinsongLi1,*杨辉…………李党生、徐国良、李劲松（cell）汇报人：付玮玮首先引入本文献一些生物学专业名词1.AG-haESCs：(AndrogeneticHaploidEmbryonicStemCells)，孤雄单倍体胚胎干细胞；2.ICAHCI：(intracytoplasmicAG-haESCinjection),胞浆内孤雄单倍体干细胞注射；3.ICSC:(intracytoplasmicsperminjection),卵胞浆内单精子注射；4.GVoocytes:卵巢发生泡期的卵母细胞，是初级卵母细胞的一种状态；5.SCmice:(semi-clonedmice)半克隆小鼠6.PB:(polarbody)极体7.PPB:(pseu-dopolarbody)假极体8.PPN：假原核9.Mitoticspindle:有丝分裂纺锤体10.EGFP：增强型的绿色荧光蛋白11.hmc:5-羟甲基胞嘧啶；mc:5-甲基胞嘧啶12.Retardedmice：阻滞小鼠、发展迟缓小鼠13.morulasandblastocysts：桑葚胚、囊胚桑葚胚：一个受精卵经过多次分裂，形成具有数十或数百个细胞，这个细胞团组成的早期胚胎就是桑葚胚。桑葚胚进一步发育，形成一个中空的细胞球，这个具有空腔的胚胎叫囊胚。14.hpa:(hourspostactivation):激活后几小时15.Hoechst：一种DNA染料，可与DNA小沟结合，也可穿过细胞膜，结合于活细胞或固定过的细胞，用于活细胞标记。16.正常小鼠的染色体数目为20对，即19对+XX或19对+XY。17.FACS:(fluorescenceactivatedCellsorter),荧光激活细胞分类仪（流式细胞仪）。18.CGH:(comparativegenomichybridization),比较基因组杂交。19.基因印记：使基因的表达受到抑制，导致被印记的基因的功能丧失；父系印记就是父系等位基因不表达，而母本来源的基因得到表达。一、前言在有性生殖的生物中，单倍体配子——卵细胞和精子，可以将基因传递给下一代。然而，由于卵细胞和精子的结构和功能已经特化，不能在体外进行长期稳定的繁殖培养，也就无法进行基因操作和筛选。因此，需要建立单倍体细胞系，在体外进行培养，代替配子构建动物模型。最近三十年间，老鼠单倍体胚胎已经采用不同的策略获得，但从这些胚胎中建立的胚胎干细胞却最终变成双倍体。在人类中，接近于单倍体的细胞系来自于肿瘤，但由于存在基因突变而不能形成稳定的单倍体基因组。近期，相对稳定的单倍体胚胎干细胞来自小鼠的孤雌胚胎，可以用于遗传正反向筛选，并可使用荧光激活细胞分类仪对该类单倍体细胞进行富集。然而，研究结果并未显示，得到的小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞是否能够嵌合到生殖系。如果不能，就不能将基因性状传递给下一代，基因研究工作就只停留在细胞水平，无法上升至动物水平。基于此，本研究小组设想，如果在体外能够获得孤雄单倍体胚胎干细胞系，同时能维持很好的孤雄印记，那么，这些单倍体细胞就可能取代精子，在注入卵母细胞后得到正常的小鼠个体。在本研究中，我们建立了从孤雄囊胚中诱导haESCs的方法，且haESCs在各项检验指标中均显示出具有发展潜能。更重要的是，这些AG-haESCs可以注入到卵母细胞中形成正常的可以传代的小鼠。二、文章主要设计思路概括图第一步，建立孤雄单倍体胚胎干细胞系，完成AG-haESCs的传代；第二步，将AG-haESCs

作为人造精子注入卵母细胞，培育出健康的具有繁殖能力的半克隆小鼠。三、文章结构框架流程图(主要通过6幅图展开)1.从孤雄囊胚中诱导AG-haESC细胞系2.验证AG-haESCs的多能性3.检测AG-haESCs父系印迹状态4.检测AG-haESCs注入卵细胞后胚胎发育结果5.验证基因性状可从AG-haESCs传递至SC小鼠后代6.在AG-haESCs中可进行基因操作图1.从孤雄囊胚中诱导AG-haESC细胞系

采取了两种策略来获得小鼠孤雄单倍体胚胎：(1)：向去核的卵母细胞中注射一个Oct4-EGFP转基因小鼠的精子头部；(2)：去除与Actin-EGFP转基因雄鼠交配后受精的合子胚胎中的雌原核。这两种方法所获得的重构胚均能发育至囊胚，并在体外形成小鼠胚胎干细胞系。图1A为从孤雄囊胚中建立AG-haESCs示意图，精子携带Oct4-EGFP转基因；图1B为重构胚激活lh后，通过Hoechst染色可以看到精子头开始解聚；图1C为精子注入去核卵母细胞后形成的雄原核的表观遗传修饰结果，左图显示，在受精卵中，5hmc和5mc分别富集在雄原核和雌原核中，右图显示，精子注入去核卵母细胞后形成的雄原核同样有5hmc的富集；图1D为携带Oct4-EGFP转基因的精子注入去核卵母细胞后，形成的孤雄桑葚和囊胚荧光和相差图，标尺为100μm;图1F为AG-haESC细胞系(AGH-OG-1)的克隆形态，标尺为50μm;

第一种方法

图1E为通过几轮流式分选富集单倍体细胞后建立haES细胞系（以AGH-OG-3为例），用DAPI通道分选经Hoechst染色的DNA，control组为两倍体ES的流式图；图1G为针对性染色体的PCR结果，AG-haESC细胞系只有X染色体，没有Y染色体；正常的双倍体ESCs（雄性XY，雌性XX）作为对照；图1H为核型分析结果，显示AGH-OG-3有20条染色体（19+X）；小鼠正常的单倍体组成为20条染色体。图1I为haESCs(AGH-OG-3)与雄性小鼠肾细胞(C57BL/6)的CGH分析结果，上面一排为haESCsvs.肾细胞，下面一排为肾细胞vs.肾细胞。第二种方法图S1A通过去除与Actin-EGFP转基因雄鼠交配后受精的合子胚胎中的雌原核建立AG-haESCs示意图图S1B为受精卵母细胞去除雌原核的图片和囊胚表达由精子携带的Actin-EGFP转基因的图片。左图显示，在受精卵中，5hmc和5mc分别富集在雄原核和雌原核中；中间图显示，受精卵去除雌原核后形成的雄原核同样有5hmc的富集；右图显示，孤雄囊胚中EGFP基因的表达；PB为极体。图S1D为AG-haESC细胞系(AGH-EG-1)的克隆形态，标尺为50μm;

（S）（S）（S）图S1C为通过几轮流式分选富集单倍体细胞后建立haES细胞系（以AGH-EG-1为例），用DAPI通道分选经Hoechst染色的DNA。图S1E为核型分析结果，显示AGH-EG-1有20条染色体（19+X），显示为单倍型。图S1F为AGH-EG-1的CGH分析结果，haESCsvs.肾细胞杂交的结果显示单倍体胚胎干细胞维持了基因组的完整性。（S）（S）（S）图2.验证AG-haESCs的多能性

图2A显示ESmarker在AG-haESCs

中的表达，采用免疫染色，标尺为50μm。其中，Oct4、Nanog、Sox2、SSEA1是保持胚胎干细胞多潜能性和自我更新的中心物质。细胞核被DAPI染成蓝色，带有TexasRed红色荧光染剂的蛋白与蓝光重合，说明这些蛋白定位在细胞核中，与它们是转录因子相符。散点图（S）（S）图2B显示AG-haESCs的基因表达谱，Pearson相关系数用红色暗示。（1）5种不同的AG-haESCs干细胞系聚集在一起，显示它们有高度相似的表达概况；（2）AG-haESCs与双倍体ESCs(雄性)表达相似，而与MEF(雄性小鼠胚胎成纤维细胞)显著差别;（3）rep1,rep2,rep3表示生物复制图2C:Oct4-EGFP标记的AG-haESCs细胞注入正常二倍体囊胚后的性腺，上图为白光下看到的卵巢，下图为来自于嵌合体的卵巢(左)与来自于对照组的卵巢(右)的比较。图2D左图为Actin-EGFP标记的AGH-EG-1ES细胞注入正常二倍体囊胚后产生的嵌合体小鼠，胚外组织(上)来源于母体，因此没有绿色荧光；右图为AGH-OG-2haESCs(C57BL/6,黑)注入正常ICR(白）囊胚后产生的7周大的嵌合体小鼠；

图2E为流式分析EGFP阳性和EGFP阴性细胞的DNA含量，E-Texas-Red和FITC通道分别用来检测PI与GFP信号图3.AG-haESCs父系印迹状态图3A：依据微阵列分析，列出的印记基因在AG-haESCs和正常双倍体ESCs

E14细胞中有超过2倍的表达差异。P代表父本等位基因、M代表母本等位基因。所有的父本印记基因（也就是只能在母源中表达的基因）发生下调，除H19外；而与之相反，所有的母本印记基因（只能在父本等位基因中表达）发生上调。父本印记基因母本印记基因图3B为定量反转录PCR(qPCR)检测印迹基因表达,(*:0.01<p<0.05；**：0.001<p<0.01;)母本印记基因父本印记基因

图3C为小鼠尾巴、精子和AG-haESCs(AGH-OG-3)中Gtl2，H19，和Snrpn基因DMRs的甲基化检测，空圆和实心圆分别代表非甲基化与甲基化CpG位点。父本印记基因在精子和AGH-OG-3中发生下调，也就是抑制表达，因而甲基化程度与体细胞相比较高；母本印记基因在精子和AGH-OG-3中应该发生上调，因而甲基化基本不存在。母本印记基因父本印记基因父本印记基因（S）（S）图S3A为MⅡ期卵母细胞印记基因甲基化状态；图S3B

为卵丘细胞（体细胞）印记基因甲基化状态。H19和Gtl2是父本印记基因，只能在母源中表达，因此在MⅡ期卵母细胞的甲基化很少，而Snrpn是母本印记基因，只能在父源中表达，MⅡ期卵母细胞为母源，因而甲基化程度非常高。卵丘细胞为体细胞，它的甲基化程度只是作为对照。父本印记基因父本印记基因母本印记基因（S）图S3C/D/E/F为H19(父本印记基因)在4种孤雄单倍体胚胎干细胞中经过不同传代次数的甲基化动态变化状态。从图中可发现，在经过一定次数的传代后，仍可维持其父本印记状态。图4.显示AG-haESCs注入卵细胞后胚胎发育结果

图4A为ICAHCI产生SC小鼠的示意图，重构胚激活后，由卵细胞产生的第二极体(PB)和由M期haESC产生的假极体(PPB)分别排出后，形成一个二倍体胚胎，AG-haESCs携带EGFP转基因，PPN为来自于haESC的假原核；图4B显示AG-haESC的重编程，左边和中间为重构胚激活0h和lh的Hoechst染色图，右边是重构胚激活6h后的染色图，5hmc(红色)和5mc(绿色)分别富集在假原核和雌原核中；

图4C显示ICAHCI(AGH-OGESCs注入卵母细胞)与ICSI(精子注入卵母细胞)生成的囊胚图,供体haESCs和精子携带Oct4-EGFP转基因,标尺为100μm;图4D显示来自于AGH-OG-3haESCs的ICAHCI产生的半克隆(SC)小鼠，图中显示的是在假孕母鼠妊娠19.5天时剖腹产所获得的小鼠和胎盘，星号所标示的是生长阻滞SC小鼠，在出生后一小时内死亡；

图4E显示SC小鼠出生时体重和胎盘重量，对照组(control)小鼠由ICSI获得，“正常”SC小鼠体重（1.4±0.18g，n=21)与对照组(1.4±0.2g，n=17)接近，前者能活到成年，而“阻滞”SC小鼠出生时则个体偏小(0.6±0.13g，n=22)，在出生后一小时内死亡，值为平均值士标准差,***p<0.001;图4G显示由ICAHCI方法操作AGH-OG-2获得的两只八周龄大的SC小鼠。图4F显示对照ICSI小鼠(上)、正常SC小鼠（中）和阻滞SC小鼠（小）的H19的甲基化状态；可以看出SC小鼠与对照小鼠的甲基化状态非常相似图5.基因性状从AG-haESCs传递至SC小鼠后代

图5A显示,(上)从携带Oct4-EGFP转基因的AGH-OG-1而来的新生SC小鼠卵巢和(下）从四周大SC小鼠中分离出来的GV卵母细胞,绿色荧光标示的是表达Oct4-EGFP的生殖细胞,标尺为200μm(上)和100μm(下);图5B显示由AGH-OG-1获得的SC母鼠的后代；图5C显示对后代的基因型分析,该SC母鼠的后代中50%(8/16)为Oct4-EGFP阳性；图5D显示SC母鼠雌雄两种性别的后代均有AG-haESC的生殖系遗传，左边两图显示一周大的雄性F2幼鼠的输精管中有Oct4-EGFP转基因的表达，Oct4会在这只新生雄鼠的整个生殖母细胞群中均有Oct4的表达，右边两图显示从两周大雌性F2幼鼠中分离出的GV卵细胞中有Oct4-EGFP报告基因表达，EGFP信号说明了在发育中的卵母细胞中存在着Oct4表达，标尺为100μm。图6.在AG-haESCs中进行基因操作

图6A为针对Vwce

基因的同源重组打靶策略。编码外显子由黑色方框标示，1号外显子的5‘非编码区部分由空白方框标示，位于neo筛选标志一侧的Fr