第六章第三节样品净化技术

溶解后的样品，进入IC分析前，常需要净化。净化的方法有简单的滤膜过滤或进一步处理，即从复杂基体中选择性地富集痕量待测离子或选择性地去除基体。常用的样品净化技术一般为固相萃取法、固相微萃取法、膜分离法等。固相萃取法(SPE)是一个非常有用的样品处理技术，专门用来进行分析前的样品纯化和浓缩，是由液-固萃取和柱-液相色谱技术相结合发展起来。1978年出现一次性SPE商品柱，自出现以来，以10%的年增长率扩大其应用。在很多情况下，SPE作为制备液体试样优先考虑的方法取代了传统的液-液萃取法。第三节

样品净化技术一、SPE的特点3.1

SPE特点及使用范围⑴在许多分析方法中已经取代传统的溶剂萃取技术；⑵节省分析时间，简单，快速，是液-液萃取法的1/10；⑶不使用超纯溶剂，减少有机溶剂的使用和有机废物的产生，消除溶剂对人体和环境的危害；⑷高效、快速，可同时处理多个样品（小体积）；⑸提高回收率，改善重现性；⑹无乳化现象。

SPE是柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与HPLC有许多相似之处。SPE柱的填料粒径﹥40μm，要比HPLC填料(3-10μm)大。由于柱床短和粒径大，SPE柱效N比HPLC柱效N低得多。HPLC柱效N﹥10000；SPE柱效N﹥10-50。因此用SPE只能分离保留性质有很大差别的化合物。二、SPE不足之处及性能比较缺点：⑴SPE的截面积小，流量低（环境和生物样品）；⑵处理液体样品的时间长；⑶容易堵塞；⑷吸附剂生产批次之间的差异导致重现性差；⑸柱是一次性使用。

薄膜SPE具有截面积大，不易堵塞，可以高流量，处理时间短的特点，因而代替了柱形SPE的趋势。

膜状SPE有两类:①薄膜中混合了各种化学键合固定相填料微粒，其中填料含量占90%；②薄膜本身直接经化学反应键合了多种不同的官能团。

填料用量相同时，膜状SPE流量大，流速低，处理时间短。柱状与薄膜SPE性能的比较⑴从试样中除去对后续分析有干扰的物质；⑵富集痕量组分，提高分析灵敏度；⑶变换试样溶剂，使之与分析方法相匹配；⑷原位衍生；（改善样品其挥发性，减弱基团和化合物极性，提高挥发度）。⑸试样脱盐；⑹便于试样的储存和运送。三、SPE的使用范围1.普通使用的SPE柱

容积为1-6mL的柱体，通常是医用聚丙烯管，在两片聚乙烯筛板之间填充0.1-2g填料，常用的填料是C18，这种填料疏水性强，在水相中对大多数有机物显示保留，也可以使用其它具有不同选择性和保留性质的填料，如C8，-CN，-NH2，-C6H6，双醇基填料，硅胶,氧化铝，硅酸镁，聚合物，离子交换剂，排阻色谱填料，亲和色谱填料。3.2

SPE装置一、柱构型

近几年，发展了许多金属性SPE固定相，针对特定环境，毒品和生化试样而设计的。具有活性基团或经活性化合物涂渍的SPE固定相可用于分析物衍生化反应。对纯度的考虑：①一般选用医用聚丙烯作为柱体材料(含微量杂质),当经处理的试样后，用高灵敏度的方法(ECD，FID，GC-MS)进行分析，这些杂质可能被检测。为了降低SPE空白的杂质，可选用玻璃，纯聚四氟乙烯（PTFE）作为柱填料。筛板填料是另一个可能的杂质来源。制作筛板的填料有聚丙烯，PTFE，不锈钢和钛金属筛板不含有机杂质，但易受酸的腐蚀。从柱体，筛板和填料都可能向试样中引入杂质，在建立和验证SPE的方法时，必须做空白萃取实验，这对痕量分析尤为重要。2.SPE盘

表观上与膜过滤器十分相似，盘式萃取器是含有填料的PTFE圆片或载有填料的玻璃纤维片，后者较坚固，无须支撑。填料约占SPE盘的60~90%，盘的厚度约1mm，由于填料颗粒紧密的嵌在盘片内。SPE柱和盘式萃取器的主要区别：在有床厚度/直径（L/d）比，对于等重的填料，盘式萃取的截面积比柱约大十倍，因而允许试样以较高的流量通过，SPE盘的这个特点适合从水中富集痕量的污染物。1L纯净的地表水通过直径为50mm的SPE盘仅需15~20min。1.离线SPESPE与分析独立进行，SPE仅为以后的分析提供合适试样，与SPE柱相配合的SPE装置非常简单。①凭借重力，溶剂就可以通过萃取柱,但流量较低。②使用注射器加压或吸滤瓶抽气可以增加溶解的流量。多支管抽气装置能够同时处理数个萃取柱,为了使试样溶液与填料有足够的接触,溶剂流量不应过高。③对于SPE柱流量应保持每分钟数毫升。SPE盘截面积大，允许溶剂以较大的流量通过。离线SPE操作可以由SPE仪器完成：由柱架、活塞泵、储液槽、管线和试样处理器完成。二、在线和离线SPE2.在线SPE

在线SPE又称在线净化和富集技术，主要用于HPLC分析。通过阀切换将SPE处理试样和分析统一在一个系统中。SPE操作步骤包括:(1)柱预处理；(2)加样；(3)洗去干扰物；(4)回收分析物。3.3

SPE操作步骤

在加样和洗去干扰物的步骤中，部分分析物有可能穿透SPE柱造成损失。而在回收分析物步骤中，分析物可能不被完全洗脱，仅有部分残留在柱口。最理想的情况是分析物100%回收到收集的级分中，但并不是总能达到。萃取样品之前，为润湿固相萃取柱填料，用一满管溶剂冲洗管。1.反相类型硅胶和非极性吸附剂介质通常先使用数毫升甲醇通过萃取柱，再用水或缓冲溶液顶替滞留在柱中的甲醇。甲醇润湿吸附剂表面和渗透键合烷基相，这些溶剂通常是与洗脱剂一样，可消除固相萃取管上的杂质及对分析物的干扰。2.正相类型硅胶和极性吸附剂介质通常用样品所用的有机溶剂来处理。离子交换填料用于非极性有机溶剂中的样品，用3-5mL的去离子水或低浓度的离子缓冲溶液来处理。为了使固相萃取填料从预处理到样品加入时都保持润湿，允许大约1mL的预处理溶剂在管过滤片或萃取片表面之上。一、柱预处理柱预处理的目的:①除去填料中可能存在的杂质；②使填料溶剂化，填料未经预处理或未被溶剂润湿，能引起溶质过早穿透，影响回收率。

如果样品是从一个液管或过滤管引入固相管，则多加0.5mL，最后的预处理溶剂到1mL的固相萃取管中，如果是2mL到3mL的萃取柱中，多加入4-6mL管中等等。这是为了保证在样品加入之前萃取柱湿润。如果在样品加入之前，萃取柱中的填料干了，需重复预处理过程。在重复引入有机溶剂之前，一定要用水冲洗柱，洗去其中缓冲溶液的盐。

预处理后，试样溶液被加至并通过SPE柱。在该步骤中，分析物被保留在吸附剂上。为了防止分析物的流失，试样溶剂强度不宜过高。当以反萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（v/v）。二、加样克服加样过程中分析物流失的方法：①可用弱溶剂稀释试样；②减少试样体积；③增加SPE柱中填料量和选择对分析物有较强保留的吸附剂。

用中等强度的溶剂将干扰组分洗脱下来，同时保持分析物停留在柱上。对反相萃取柱，清洗溶剂是含适当浓度的有机溶剂的水溶液或缓冲溶液。通过调节清洗溶剂的强度和体积，尽可能多的除去被洗脱的杂质。为了确定最佳清洗溶剂的浓度和体积，加试样于SPE柱口，用5-10倍SPE柱床体积的溶剂清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱轮廓图。依次增加清洗溶剂强度，根据不同强度分析物的洗脱轮廓图，决定清洗溶剂合适的强度和体积。三、除去干扰杂质（冲洗填料）将分析物完全洗脱并收集在最小体积的级分中。同时使比分析物更强保留的杂质尽可能多的停留在SPE柱上，洗脱溶剂的强度是非常重要的。⑴较强的溶剂能使分析物洗脱并收集在一个小体积的级分中，但有较多的强保留杂质同时被洗脱下来。⑵用较弱的溶剂洗脱，分析物级分体积较大，但含较少的杂质。

为了提高分析物的浓度或为以后分析调整溶剂性质，可以把收集到的分析物级分用氮气吹干，再溶于小体积适当的溶剂中。为了选择合适的洗脱剂强度和体积，加试样于SPE柱上可以改变洗脱剂的强度和洗脱液的体积，测定分析物的回收率。

四、分析物的洗脱和收集

步骤一步骤二步骤三步骤四预处理加样冲洗洗脱

目标化合物非目标化合物杂质和介质

从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多个因素的影响，实验条件是影响重现性的主要原因。提高重现性的方法：⑴使用内标法，加入适当的内标作参比;⑵加入样量适当，不超出穿透量和穿透体积;⑶选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。随着自动化仪器的出现，可同时处理几个或几十个样品，自动加液全部实现计算机操作。

建立SPE方法之前，首先要了解分析物的性质及有关信息。影响SPE固定相和洗脱剂选择的因素：⑴试样基质和分析物的性质，如：结构、极性、溶解度和酸碱性质等；⑵试样中分析物的浓度或浓度范围;⑶样品溶剂的性质，试样中存在哪些对选择的分析方法有干扰的杂质；⑷用什么方法进行试样分析，该方法对试样有什么要求;⑸试样预处理所要达到的目的。SPE分离另一种情况是杂质被保留，分析物通过柱，此时试样被净化，但不能使分析物富集，也不可能分离保留性质比分析物更弱的杂质。SPE主要应用在环境分析，药物分析，临床分析和食品饮料分析中。SPE应用在处理环境和生物液试样时，最能体现该技术的特点。如测定水中的油脂，(美国环保局，USEPA1664)，水样首先用氟里昂或正己烷萃取。前者由于破坏臭氧层已被禁用，后者比水轻容易形成乳浊液。若用SPE处理试样就简单的多同时可节省溶剂，在一些USEPA建立水样方法已经允许使用SPE代替LLE。SPE技术为USEPA所接受，还专门研制SPE柱(专属)。3.4

SPE应用展望：⑴用球形硅胶或高聚物作为填料基质和改进合成方法，提高柱效和重现性；⑵引进新型选择性高或特效性的填料和具有不同极性的新型SPME纤维；⑶继续完善和改进柱构型，提高工作效率，满足各种试样的不同要求。⑷新材料和填料制备SPE装置，减少空白的杂质，扩大SPE在痕量分析中的应用。⑸进一步改进自动仪装置，提高工作效率。3.5膜萃取简介膜萃取是膜技术与萃取过程相结合的新型膜分离技术，又称固定膜界面萃取。在膜萃取过程中，萃取剂和料液分别在膜两侧流动。其传质过程是在分隔料液相的萃取相的微孔膜表面进行的。没有相分散行为发生。⒈膜萃取过程没有相的分散和聚结，可减少因液滴分散在另一液相中而引起的夹带现象和随之产生的溶剂损失。⒉膜萃取过程没有直接接触的液液两相流动，因此选取萃取剂时，对物性（密度、粘度、界面张力）的要求可大大放宽。⒊由于膜萃取过程中两相分开流动，可以避免在一般逆流萃取柱中严重影响传质效果的轴向返混现象。膜萃取的特点：⒋由于膜萃取过程可以实现同级萃取，反萃取及利用萃合物载体促进迁移，可以提高萃取过程的传质推动力。⒌与一般萃取比较，膜萃取的缺点是增加了一层膜的阻力被萃取组分要经过三个步骤：⑴由料液水相主体到膜面；⑵扩散通过膜；⑶由膜的另一面到萃取有机相主体才能完成总传质过程。膜阻使过程的总阻力增大，总传质系数下降。克服办法选用膜材料加以克服。⒍在膜萃取过程中可能发生的相互渗透，膜的溶胀及影响膜的使用。几乎所有常规的分相溶剂萃取都可以用膜萃取代替。目前使用微孔膜的溶剂萃取主要用于以下6方面：⒈金属萃取⒉有机污染物萃取⒊芳烃萃取⒋药物萃取⒌发酵产物萃取⒍萃取生化反应3.6

膜分离法的应用指组分主要依靠在互不相溶两液相间的选择性渗透、化学反应、萃取和吸附等机理而进行分离的。显然当被隔开的两个溶液是有机溶液时，液膜则应该是水型；相反，当被隔开的两个溶液是水溶液时，液膜则应该是油型。

3.7

液膜分离例如:处理废水（含铬废水），常采用加入叔胺R3N起萃取剂（流动载体），相应内相试剂选用碱、反萃取剂。反应式：

2R3N+2H++Cr2O72-=(R3NH)2Cr2O7

油膜相外相（料液）油膜相

(R3NH)2Cr2O7+4OH-=2R3N+Cr2O72-+3H2O

膜相内相试剂膜相内相

液膜萃取除铬的优点之一是把萃取和反萃取结合在一起同时进行，使得铬离子一旦与膜相中流动载体形成配合物便立即被内相试剂捕集，从而加大了过程的推动力，提高分离效果。此法也可以用于处理含CN-、NO3-和NO2-等阴离子的废水。生化方面：主要是酶，包括尿素酶，胰蛋白酶可以用液膜封闭，不会降低酶的活性；

医学方面：不需要破乳液膜人工肺、液膜人工肝、液膜人工肾、液膜解毒及缓释药物等。

冶金方面：稀有金属和稀土金属分离。

沉淀分离和溶剂萃取法在提高选择性方面的研究都取得了新进展。其中共沉淀富集痕量元素的技术已趋成熟，溶剂萃取法就正在不断研究开发了新的萃取剂，新的萃取体系。

离子交换分离的进展主要集中在高选择性吸附能力的离子交换体系或吸附剂的研究和应用上。如合成高选择性多种功能团的螯合树脂、螯合纤维素、负载有固定螯合功能团的树脂、纤维素、还有植物体吸附(木质素)

、微生物吸附(有藻类、细菌、真菌、酵母)等

。尤其在有色金属和贵金属方面应用的比较多。一、经典的分离富集技术的不断完善3.8

离子色谱样品前处理技术发展趋势吸附预富集分离方面的进展：⑴吸附剂种类的多样化：新型螯合树脂；生物吸附剂：植物体：如柿子皮、植物茎和叶；

微生物：藻类、细菌、真菌、酵母等。(2)对吸附机理研究的深入化：使用FTIR、XRD、XPS对吸附机理进行探究和表征。壳聚糖（Chitosan），β-2-氨基-2-脱氧-(1,4)-D-吡喃葡萄聚糖。一种弱碱，不溶于水，溶于pH<6的有机酸。⒉各种分离技术相互渗透

近20年来，最有意义的是发展了萃取色谱，泡沫吸附以及萃取分离技术（固相萃取、固相微萃取、气相萃取、超临界萃取、微波萃取、膜萃取、加速溶剂萃取、微量化学法及自动化核酸提纯系统）。其中相当一部分前处理技术-无溶剂萃取技术。另处还有新的分离技术，毛细管电泳、毛细管柱电色谱和超临界流体色谱等使应用领域十分广泛。萃取色谱：将有机萃取剂或配合剂等吸附在惰性载体上作为固定相，以无机物质（如酸、碱溶液）为流动相。是将溶剂萃取和色谱相结合的一种新的分离技术。特点：㈠萃取色谱的固定相为有机萃取剂，流动相为水溶液，比较容易选择合适的水相组分。萃取剂在不同水相条件下萃取金属离子的分配比，可作为萃取色谱选择分离条件的借鉴。㈡固定相的萃取剂种类较多，如：磷类、胺类、含氧的醚和酮类、螯合萃取剂、混合萃取剂、新的冠醚类大环化合物都可以用于萃取色谱，获得良好的分离。㈢萃取剂固定在惰性支持体上，其用量比溶剂萃取少。一般不怕乳化现象，柱可以反复利用。㈣萃取色谱相当于级数很高的多次萃取，分离效率高，并能有效地分离性质相似的元素及含量很少的放射性元素。㈤操作简便，易于实现自动化。⒊分离富集技术的自动化

流动注射FI技术是能够实现样品自动引入、稀释、在线分离富集与仪器联机，提高分析性能：FI-CE，膜分离技术联用和液相发光仪器一体化，受到关注。还有微流控芯片技术可使样品在芯片上实现在线酶解分离富集检测（蛋白质组学）。

微流控芯片(Microfluidic)：是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验。图3.2芯片照片及实验过程示意图⒋发展化学形态分析的分离富集方法⑴形态分析：分析化学的一个分支，它包括物理形态分析和化学形态分析。IUPAC于2000年统一规定了痕量元素形态分析的定义：化学形式(chemicalspecies)：一种元素的特有形式，如:同位素组成、电子或氧化状态、化合物或分子结构等。形态(speciation)：一种元素的形态即该元素在一个体系中特定化学形式的分布。形态分析(speciationanalysis)：识别和(或)定量测量样品中的一种或多种化学形式的分析工作。分步提取(fractionation)：根据物理(如粒度、溶解度等)或化学性质(如结合状态、反应活性等)把样品中一种或一组被测定物质进行分类提取的过程。

有时某些样品中元素的不同化学形态的测定很难做到。因为样品中存在的化学形态往往不是很稳定.在整个分析过程中可能会发生变化。

化学形态分析对了解环境元素的毒性及其对生态系统的影响极为重要，己成为近年来越来越引人关注的课题。对于环境中的痕量无机元素的价态、化合态、金属有机化合态进行分析是近年来化学分析中非常活跃的领域。形态分析的主要挑战是样品处理问题，即如何完整无损的将原始样品中存在的各种形态定量分离。最合理的形态分析应该是通过直接探测天然环境中原始样品的在线实时分析。但目前多数方法需要采集样品并在实验室中预处理之后进行分离和测定。显然.这种方法存在着一些缺陷，在分析期间存在形态改变的可能性。

目前固体样品的前处理一般采用选择性浸取、辅以加压、超声、微波等手段。准确形态分析的主要手段是联用技术，即先用有效的在线分离技术将某种元素的各种化学形式进行选择性分离，然后用高灵敏度的无机元素检测技术进行测定。这些联用技术正在环境科学、临床化学、毒理学和营养学等领域不断扩大应用范围。最常用的做法是依据被分析物的物理化学特征，如挥发性、电荷、极性、质量及分子的空间结构等性质，选择GC、HPLC、IC、SFC、CE等现代色谱学分离技术进行被测物质的形态分离。然后用AAS、AFS、MIP-AES)、ICP-AFS)和ICP-MS等高灵敏度、高选择性的无机元素检测技术进行测定。(1)GC在形态分析中：GC比较适合挥发性金属及金属有机化合物的分析，对于难挥发金属及其金属有机物，需要转变成挥发性的化合物，通常是利用各种衍生化方法使其转变成金属共价氢化物或螯合物，保留时间被用作鉴定的依据。GC分离系统：GC色谱柱和毛细管柱均己广泛用于手性化合物的分离。填充柱的优点从是在有油脂或有机物残渣沉积后，可通过更换部分填料而消除污染。此外，毛细管柱及大口径开管柱也被广泛地应用。柱效高、分辨率好、尖锐的峰形可导致灵敏度的提高。检测系统：AAS和AFS选择性较高，是金属有机化合物形态测定中广泛使用的检测技术。主要缺点是灵敏度随着待测形态挥发性而改变。冷蒸汽(CV)AAS可用少各种有机汞的GC流出物测定。AFS具有很高的灵敏度，适于易挥发元素的测定。还有GC-ICP-MS等。(2)HPLC和IC在形态分析中的应用与GC相比HPLC通常是在室温下进行，对高沸点和热不稳定化合物的分离不需经过衍生化，因而使得HPLC更适合于环境分析以及生物活性物质分析。同时，HPLC拥有较多的可改变的因素(包括固定相和流动相等)，使得HPLC的适用性更为广泛。

HPLC分离系统：在化学形态分析中应用较多的是IC，因其具有分离游离或络合物离子型化合物的能力。反相(RP)-MPIC由于利用了离子对试剂，因而也能广泛用小分子型化合物的分离。HPLC和RP-MPIC可用于Se、Hg、As、Sn和Pb等元素的形态分离。检测系统目前，所有与HPLC联用的检测系统中，原子光谱和质谱己证实最适合于痕量元素的化学形态分析。1.植物、粮食及其它生物试样的预处理

对植物、粮食及其它生物试样中微量无机成分的测定，通常采用原子吸收光谱法、等离子体原子发射光谱分析法或离子色谱法。动植物组织、血液和尿等试样，除极少数可直接进样外，一般都须预处理。让样品风干或烘干，剖碎过筛后称样，将样品灰化，使有机物质分解，而被测元素转入溶液之中。常用方法为干法灰化后，用硝酸或盐酸溶解灰分；或用强酸消化，使有机物分解，通常采用混合酸破坏有机物更有效或用合适试剂浸提被测元素等。(1)测定无机成分时植物、粮食及其它生物试样的预处理3.9、样品前处理示例

准确称取2.0-5.0g粉碎样品于坩埚中用小火炭化至无烟后，冷却。小心滴加几滴硝酸，使残渣湿润，然后用小火蒸干移入高温炉中于600℃灰化2h，冷却后取出。如灰化不完全再按上述操作滴加硝酸湿润残渣，小火蒸干移入高温炉中于600℃继续灰化直至样品全部变成白色残渣，冷却后取出。残渣先加少量蒸馏水湿润，再加入1mol/L硝酸2mL，转移至25mL容量瓶中，坩埚用蒸馏水少量多次冲洗于容量瓶中，定容，溶液供测定用，同时做试剂空白。(2)离子色谱法测定粮食样品中铅和镉样品处理

土壤中的无机元素的定性及定量测定比较简单。对于常量和微量元素的测定，可以用离子色谱法、原子吸收光谱法以及电感耦合等离子体发射光谱法。采用电感耦合等离子体直读光谱仪可以同时分析Si，Al，Fe，Mg，Ca，Ti，Mn及P等28种元素，分析时间不到3min，且精密度好。对土壤中有机成分的分析比较复杂一些，例如研究不同土壤中的腐殖酸的化学结构。这些结构各不相同的有机化合物，虽然用红外光谱法、气相色谱-质谱联用等可以得到很好的解决，但分离仍是关键的一步。2.土壤中常量、微量元素及有机成分的研究

研究土壤组成的常用分离方法有溶剂萃取、薄层色谱、制备气相色谱等，为了获得满意的分离，必要时还须进行化学衍生化。为了使非极性有机化合物不漏检，因此