农残分析9-气相色谱法2

四、色谱柱

色谱分析是一种先分离后检测的分析方法。分离过程是由色谱柱来完成的。一个特定分离的成败，在很大程度上取决于色谱柱的选择。因此，色谱柱是气相色谱的心脏。

(一)色谱柱的几种类型气—固填充柱、气—液填充柱、毛细管柱以及填充毛细管柱等。

气-液填充色谱柱是在柱管中装填着表面涂有一薄层高沸点有机物液膜的惰性固体作为固定相，高沸点有机化合物是固定液，而惰性固体是载体。

(二)柱管材料与形状1．柱管材料

选择柱管材料的主要依据之一是柱管壁表面的特性。常用玻璃柱和不锈钢柱。2．柱管形状

柱的形状并无一定特殊要求，常用形状有U形和螺旋形两种。实践证明，只要填充的均匀紧密，柱形状对柱效没有显著的影响。3．柱的内径和长度

填充柱的内径一般为2—6mm，常用4mm。柱内径细，柱效高，为了提高柱的装填量，最好采用细颗粒度的载体。柱长从0.5m一6.0m均可选用，具体柱长一般由分离任务的要求而定。在可能的情况下，色谱柱短比色谱柱长好．这样可以提高分析速度。

(三)固定液

涂于色谱柱(空心柱除外)填充物表层的液膜状物质即固定液。它在气相色谱分析中对各组分的分离起着决定性的作用。1．对固定液的要求

用气相色谱分析农药时，柱温一般在150一250℃左右，且化合物组分、试样类型、干扰物质等情况较为复杂，故对固定液要求为：

(1)在操作温度下蒸气压低，热稳定性好，与被分析物质或载气不产生不可逆反应。由蒸气压和热稳定性的情况决定固定液的最高使用温度。

(2)在操作温度下呈液态，而且粘度越低越好。物质在高粘度的固定液中传质速率慢，因而柱效率降低。这个要求决定了固定液的最低使用温度。

(3)选择性高，即对两个沸点相同或相近的不同类型的组分，要有尽可能高的分离能力。

(4)对样品组分有足够的溶解能力。2．固定液的分类

色谱固定液已约有千种之多，分类方法主要是根据固定液的分子结构、极性和保留指数，把固定液按三种方法分类：①按固定液的化学结构和所含官能团；②按固定液相对极性；③按形成氢键能力的强弱。因按①分类，简单、实用，便于根据样品和固定液的“相似相溶原理“选择固定液．故此种分类法在实际工作中，对农药分析参考价值较大，现介绍如下：

按固定液的化学结构和所含官能团分类，可把固定液分为10类。仅重点介绍农药分析中常用的两类。

(1)烃类：包括烷烃、芳烃和其聚合物，是非极性或弱极性固定液。其中角鲨烷是典型的非极性固定液，通常把其相对极性定为零，有标准非极性固定液之称。此外，还有石蜡油、真空脂、聚乙烯等。

(2)硅酮类：该类是目前使用最为广泛的固定液。其主要优点为：

①温度粘度系数小，柱温对柱效影响不大，使用温度范围宽。

②蒸气压低，热稳定性好，固定液流失少。

③对大多数有机物都有很好的溶解能力，有通用型固定液之称。

④硅原子上可以引入多种官能团，使其成为具有不同极性的固定液，大大扩大了应用范围。3．固定液的选择

试样分离得好坏，以及分析水平的高低往往取决于固定液也即是色谱柱选择恰当与否。在农药分析中，多用“相似相溶”原理和“以实验方法”选择固定液。

“相似相溶”原理：“相似相溶”原理是根据被分离组分与固定液之间有某些相似性，如官能团、极性、化学性质相似，则组分在固定液上的溶解度大，分配系数就大，选择性就好；反之，溶解度小，分配系数小，选择性就差。

（四）担体

担体是承担固定液的固体材料。担体又称载体。把固定液涂渍在担体表面上，形成均匀薄膜，就构成气液色谱柱的填充物。担体颗拉直径、担体颗粒均匀度、担体表面积的大小均为影响柱效的因素。担体表面的物理化学性质，担体的物理结构是影响色谱柱峰形拖尾的主要原因。

1．对担体的要求

(1)比表面积大：即指单位重量的担体具有较大的表面积，一般指每克担体具有若干平方米表面积。比表面积大，它的柱效就高；

(2)表面对溶质无吸附或吸附性很弱；

(3)热稳定性好；

(4)化学惰性：即与固定液或被分析组分不起任何化学反应；

(5)颗粒大小尽可能均匀；

(6)具有足够的机械强度。2．担体种类

色谱担体大致可分为两大类：目前硅藻土型担体，在气—液色谱中普遍大量使用，农药分析中用非硅藻土型担体甚少。硅藻土担体很多，商品有百余种。国内生产的硅藻土担体有十几种。国内外常用担体见表4—5、6。

二甲基二氯硅烷(DMCS)六甲基二硅胺(HMDS)3．担体表面的活性

色谱峰的拖尾现象，是色谱分析中经常遇到的问题。这种现象既影响柱效，又影响保留值的测量与峰面积的计算，所以解决峰形拖尾问题，一直是色谱分析中必须研究的重要课题之一。

担体表面的活性是造成色谱峰形成拖尾的主要原因。理想的担体表面无论对组分或固定液都是完全惰性的。除了特氟隆担体之外，对经常使用的硅藻土担体来说，由于表面存在相当数量的硅醚基团(—Si—O—Si—)和硅醇基团(—Si—OH)，存在杂原子基团，如＞Al—O—，＞Fe—O—等基团，担体偏酸性或偏碱性，以及晶格不均匀性，因而表面既有催化活性作用点，又有吸附活性作用点。

(1)形成氢键的活性作用点：无论哪一种硅藻土担体，其表面都存在硅醇基(硅羟基)，若被分离的组分为醇、醛、酮、酯等，能造成峰形的拖尾。

(2)酸性活性作用点：这系指表面上的酸性氧化物杂质，分离碱性胺类化合物时能引起峰形拖尾。

(3)碱性活性作用点：这系指表面上碱性氧化物杂质，能引起酸性化合物、脂肪族和芳香族羧酸酚类等峰形拖尾。

由于担体表面活性作用点的存在，它与组分之间发生的不是溶解分配作用，而是吸附作用(不可逆吸附现象)。它的分配等温线是非线性的，它的峰形是拖尾的。

担体表面的活性是造成色谱峰拖尾的主要原因。而表面活性则是由形成氢键的活性作用点、酸性活性作用点和碱性活性作用点等所引起，故为了改善峰形，担体需经去活性处理。

4．担体表面的去活性处理

吸附活性作用点，不仅存在于担体表面上，还存在于金属或玻璃色谱柱的管壁以及其它联结管路的管壁上。

消除担体表面活性的方法，大致有以下几种：

(1)酸洗法采用盐酸法、冰醋酸法、硝酸法、硫酸法和磷酸法处理担体能除去担体表面上大部分A1、Fe、Ca、Mg的杂质，从而使表面活性显著下降。通常酸洗方法系用浓盐破浸渍担体几个小时后，滤去盐酸，水洗至呈中性，然后用甲醇或乙醇漂洗，烘干，备用。酸洗除去铁和铝杂原子，可防止它们引起的催化作用。这对于分析天然产物如甾类、萜烯类以及亚硝基化合物很有意义。

(2)碱洗法

一般用5％KOH—甲醇溶液浸泡，再用水冲至呈中性，烘干备用。碱洗目的是除去表面的Al2O3等酸性作用点。(3)硅烷化法

硅烷化法是改变担体表面硅醇基团的有效方法。用硅烷化试剂和担体表面的硅醇基团起反应，可以除去表面的氢键结合能力，从而可以改进担体的性能。(五)色谱柱的制备要制备一根分离效能较高的色谱柱，必须在担体上涂上一层薄而均匀的液膜，再把涂好的固定相均匀而紧密地装填到色谱柱管内。因此，固定液的涂渍和色谱柱的装填是色谱分析重要操作技术之一。这里主要介绍填充柱。

1．色谱柱管的试漏和清洗由于存放、运输等过程可能使色谱柱管沾污或损坏，使用前应将色谱柱进行试漏与清洗。

试漏试漏的操作方法很简单，只要将柱管全部浸入水中，将其出口堵死，人口通人氮气(N2)在高于使用的操作压力下，以管壁没有气泡冒出为合格。

清洗

(1)玻璃柱管可注入洗液浸泡两次，然后用自来水冲至中性，再用蒸馏水清洗，烘干后备用。

(2)不锈钢柱管可用5％一10％的热碱(NaOH或KOH)水溶液抽洗4—5次，以除去内壁的油污，然后用自来水冲至中性，再用蒸馏水清洗，烘干后备用。

(3)已经用过的色谱柱需要重换其固定相时，柱管也应当用相应的溶剂(如乙醚、乙醇、热碱液)依次洗涤，自来水冲至中性，然后用蒸馏水清洗，以除去柱管中的担体粉末及粘附在管壁上的固定液膜，烘干后备用。2．固定液的涂渍技术

几种常用的涂渍方法：

(1)“常规”涂渍法：对配比大于5％以上(所谓配比，即固定液与担体的重量比)的固定液，可用“常规”法涂渍。其方法是：将一定量的固定液放置在一蒸发皿中，加入适量的溶剂，待固定液溶解后，再加入定量的载体。在一般实验室的条件下，固定液可借助溶剂作用涂敷在载体表面上。最后把涂渍上固定液的载体放在红外灯下轻轻搅拌，烘干并赶走溶剂。一般要求，烘干后的固定相基本上不应有溶剂气味，这样才可装入色谱柱老化后使用。

对于配比小于3％的固定液，由于固定液含量少，刚能铺盖其担体表面时，如果涂渍不均匀，老化也不能完全解决，只能采用下述两种方法涂渍：

(2)抽空盘涂法:

在蒸发皿或盘中，称取一定量固定液，加入适量的溶剂，待其完全溶解后，再加入一定量的载体，将器皿置于真空干燥器中，接水泵抽空5min，然后取出放在通风柜中，让溶剂自然蒸发或红外灯下烘干，不要搅拌也不要过筛。

(3)抽空蒸发法：

将一定量的固定液置于圆底烧瓶中，加入适量溶剂，待完全溶解后加入一定量的担体。用旋转蒸发仪使溶剂蒸发至干，然后装柱使用。3．色谱柱的填充

固定相填充的好坏，直接影响柱效能。通常采用泵抽填充法，即把色谱柱的尾端(注意，即接检测器的那一端)塞上玻璃棉，再接真空泵，色谱柱的前端(即接气化室的那一端)接上一个漏斗。在真空泵的抽吸下，不间断地从漏斗中倒入要装的固定相，并不断轻轻敲打色谱柱管，直至固定相不再进入柱管为止。4．色谱柱的老化

装填好的色谱柱要进行老化处理后，才能接至检测器使用。

老化的目的：①为了彻底除去固定相中残余溶剂和某些挥发性杂质，确保检测器不受污染，使之有较低的本底电流。②进一步促使固定液均匀地、牢固地分布在载体表面上，可以提高柱效能。

老化的方法

把色谱柱接入载气气路系统(为安全起见，一股采用氮气作为载气，不可使用氢气)，色谱柱的一端接在气化室上；另一端放空(不要接在检测器上，以免沾污)，用与操作时相近的载气流速，略高于操作温度10一20℃(仅要低于固定液的最高使用温度)的条件下，通气4—8h甚至24h。基本老化好后，再接上检测器检查。当记录仪基线平直以后，老化过程才算结束。五、定性定量分析5.1气谱操作条件的选择

（1）色谱柱

色谱柱的选择是整个分析工作中的中心工作。应针对试样的性质与要求选择柱长、柱材料、担体、固定液及吸附剂等，其中以固定液的选择为主。

（2）柱温的选择

大多数色谱柱是在等温条件下操作的,柱温的选择直接影响分析时间。

程序升温:

是在一个色谱分析周期里不断改变色谱柱的温度，使一些复杂混合物的分析能做到：1)提高分辨能力；2)峰形得到改善；3)缩短分析周期。

（3）气化温度

在保证试样不分解的情况下，适当提高气化温度对分离及定量有利。一般选择气化温度比柱温高30一70℃。（4）流速的选择

根据色谱动力学理论，流速有一个最佳值，此时柱的分离效率最高。对于大多数试样来说，为了保证快速分析，经常选择较高的流速，但当采用热导检测器时，为了检测低含量的组分，有时采用低流速。通常流速选用范围在50mL／min左右。（5）试样用量的选择

应根据试样的状况与分析的要求选择试样用量，对痕量分析或纯度分析，为了显示检测器的信号，试样用量要较大；为了有利于瞬间气化，用量要减小。5.2样品制备在气相色谱分析中，样品制备除应按一般化合物考虑外，尚需注意农药制剂以下特殊要求：1．提取溶剂选用之提取溶剂，必须保证能把农药有效成分从检测对象中提取完全。2．稀释溶剂选用乳剂、超低量油剂等稀释所用之溶剂时，必须注意其要与有效成分能充分溶解，并且在气谱上出峰快，返回基线快。3．溶剂的化学性质与规格溶剂的化学性质要稳定，不应因其与制剂中的成分反应而影响测定结果。4．提取方法可用浸泡、超声波等多种方法，但不能加热提取，以免农药分解。(一)定性分析

用气相色谱法进行定性分析，在农药分析中，常利用双柱或多柱、选择性检测器与化学方法相结合等方法进行定性分析或农药确证。近年来气谱与质谱、光谱等联用，既充分利用了色谱的高效分离能力，又利用了质谱、光谱的高鉴别能力，再加电子计算机对数据的快速处理及检索，为未知物的定性分析打开了一个广阔的前景。1．根据色谱保留值进行定性分析

各种物质在一定的色谱条件(固定相、操作条件)下均有固定不变的保留值，因此保留值可作为一种定性指标．是最常用的色谱定性方法。但其可靠性不足以鉴定完全未知的物质。2．与其它方法结合的定性分析法

(1)与质谱、红外光谱等仪器联用：其中特别是气相色谱和质谱的联用．是目前解决复杂未知物定性问题的最有效工具之一。

(2)与化学方法配合进行定性分析：带有某些官能团的化合物，经一些特殊试剂处理，发生物理变化或化学反应后，其色谱峰将会消失或提前或移后，比较处理前后色谱图的差异，就可初步辨认试样含有哪些官能团。3．利用检测器的选择性进行定性分析

利用不同检测器具有不同的选择性和灵敏度，可以对未知物大致分类定性。（二）定量分析

定量分析的根据是：被测组分的重量或该组分在载气中的浓度与色谱图上的峰面积或峰高成正比。

常用的定量方法为内标法、外标法。

制剂及原药分析对准确度、精密度要求较高，故多用内标法残留分析因检测含量极微，故对准确度、精密度较制剂要求为低，多用操作简单、计算方便的外标法。

(1)外标法

本方法系用配制已知浓度的标准样进行色谱分析，以各组分的峰高或峰面积和与其相对应的浓度作标准曲线，然后在与标准试样测定时同样的操作条件分析试样并与标准样进行比较。根据试验结果，从标准曲线中计算出试样的浓度。工厂的日常控制分折，较多采用这种方法。

外标法的优点：操作简单和计算方便，分析结果的准确性主要取决于进样量的重复性和操作的稳定性。

外标法的缺点：若仪器和操作条件不稳定时，对结果影响很大。为此，需要用标准样及时校正。

(2)内标法若测定样品中某一组分或某几个组分的含量，可以把一定量的某一种纯物质，加入到样品内作为内标物，然后进行色谱定量计算。方法的优点：定量结果比较准确，操作条件与进样量对分析结果影响不大，亦适用于低含量的组分定量。

计算方法为：通过测出内标物的峰面积和欲测定组分的峰面积后，计算该组分的含量。六、色－质联用分析(GC－MS)(一)概述