第七章电子克隆的原理和应用

生物信息学Bioinformatics编号名称第一章生物信息学引论第二章生物信息学的生物学基础第三章生物信息学数据库资源第四章DNA和蛋白质序列分析第五章系统发生分析第六章基因表达数据分析第七章电子克隆电子克隆

insilicocloning第七章什么是电子克隆？电子克隆的条件和特点；电子克隆的思路和具体例子；电子克隆中最常见的问题及解决办法；电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍；电子克隆的应用前景;内容提要：更多的有关电子克隆:水稻功能基因的电子克隆策略,中国水稻科学,2002,16:295-298水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆,遗传学报,2002,29:1012-1016?????1.什么是电子克隆？电子克隆（insilicocloning）是近年来伴随着基因组和EST计划发展起来的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法快速获得功能基因。基于原理：物种同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）1.什么是电子克隆？2.电子克隆的条件和特点：前提条件；研究物种:丰富的核酸序列信息；

比较物种:较多的基因研究；强大的计算机分析软硬件的支持。2.电子克隆的条件和特点：目前已经基本完成基因组测序的常见生物：

人小鼠大鼠线虫果蝇拟南芥水稻家鸡家蚕……各种生物的EST数目人类基因的电子克隆：

2002年4月16日的第七届国际人类基因组学大会上，我国唯一的获Poster奖论文是《人类新基因的电子克隆和实验确认》。他们发现电子克隆的4个人类基因中，有3个与相应的GenBank基因组注解不同，经过实验确认确定为GenBank中的注解错误。证明了基因组注解中存在着很多问题，需要进行实验确认。目前发表的有关人类基因克隆的绝大部分都利用了人类的基因组或EST数据。人类2/3的基因需要实验确认！植物领域才刚刚开始！电子克隆的特点：

投入低； 速度快； 技术要求不高； 针对性强等。2.电子克隆的条件和特点：种子氨基酸序列tBLASTn水稻基因组contig或BAC/PAC外显子预测RT-PCR，克隆，测序人工计算机3.电子克隆的基本思路及具体实例：EST拼接设计PCR引物水稻幼苗提取总RNA合成cDNA第一链RT-PCR克隆测序生物信息学分析种子氨基酸序列tBLASTn水稻基因组contig或BAC/PAC外显子预测RT-PCR，克隆，测序人工计算机EST拼接3OsG6PDH

的克隆以小麦G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr数据库结果3OsG6PDH

的克隆以小麦G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr数据库结果4OsG6PDH

的克隆以小麦G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr数据库结果3OsG6PDH

的克隆以小麦G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr数据库结果3.OsG6PDH

的克隆以获得的包含OsG6PDH的水稻基因组序列为对象，进行基因结构预测:方法一:

通过Softberry网站进行基因结构的预测/berry.phtml方法二:搜索水稻EST数据库，加以验证（探针序列的选择？）与玉米6PGDH（AF061837）匹配的部分水稻ESTs3.Os6PGDH的克隆：水稻OsG6PDH的基因组结构

OsG6PDH基因组序列约5kb，包括15个外显子，14个内含子,内含子序列完全符合5’GU…AG3’的特征。3.OsG6PDH

的克隆根据水稻OsG6PDH的基因组结构预测的结果,得到预测的cDNA序列(包含ORF)设计PCR引物.但是选择什么来源的cDNA模板呢?如何确定?方法一:方法二:最后通过RT-PCR的方法分离该基因,并进行序列测定.3.OsG6PDH

的克隆设计PCR引物水稻各种组织分别提取总RNA合成cDNA第一链水稻锌指蛋白氨基酸序列搜索水稻基因组库水稻锌指蛋白基因序列PCR扩增克隆EST拼接OsZFP基因家族的电子克隆流程图3.OsZFP

基因家族的克隆：3.OsZFP

基因家族的克隆：OsZFP家族3.OsZFP

基因家族的克隆：

逐个对每个ZFP基因进行完整性分析(有一定的策略)

基因表达特性分析.

设计引物,PCR扩增.有时难以确定5’端完整性：序列比较

Kozak规则[A/GNNAUGG]

起始密码子上游的同阅读框序列中是否存在终止密码子

Northern杂交

RACE技术4.电子克隆中最常见的问题及解决办法有时候难以确定其表达的时期和条件：

EST的表达时期

其他类似基因的表达时期从多组织进行扩增（尤其是基因家族的分离）4.电子克隆中最常见的问题及解决办法常用的序列数据库--GenBankGenBank

包括了所有已公布的基因组、EST数据。

Nr无冗余数据库（包括mRNA,DNA...）

dbEST

数据库GenBank提供的检索工具——BLAST

Standardnucleotide-nucleotideBLAST[blastn]Standardprotein-proteinBLAST[blastp]Nucleotidequery-Proteindb[blastx]Proteinquery-Translateddb[tblastn]Nucleotidequery-Translateddb[tblastx]

5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍常用的基因组分析软件：FGENESH:http://

最好的分析软件，可以预测多种生物的基因组结构，包括转录起始位点，编码区以及转录终子位点。GenScan:http:///genscan.html

只能进行人、拟南芥和玉米的分析国内镜像：14:8888/RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jpRiceHMM:http://rgp.dna.affrc.go.jp/ricehmmSplicePredictor:http://WebGene:http://125.r.it/~webgene/5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍常用的基因组分析软件：启动子预测：http:///

选择起始密码子上游2Kb的序列进行启动子区域的预测，同时还可以标出转录起始位点的位置，可以与softberry的结果进行验证比较。5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍电子拼接::9090/clone.html5.电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍

毫无疑问，人类的电子克隆将得到进一步的发展，越来越多的基因将通过电子克隆的方法获得，功能基因组学的研究将兴起。

植物中目前只有拟南芥和水稻公布了基因组序列，将在电子克隆中占据主要地位。尤其是水稻基因的克隆将越来越多的利用发布的序列信息资源。6.电子克隆的应用前景

随着遗传图谱与以序列为基础的物理图谱的整合，直接将目的基因（或QTL）与连锁标记的遗传距离转换为物理图距后的电子克隆有可能成为取代传统的图位克隆的重要措施(拟南芥)6.电子克隆的应用前景对于采用抑制差减杂交、差异显示或基因表达系列分析等方法得到的EST采取电子克隆的方法获得具有完整基因的策略，则可成为取代RACE或cDNA文库筛选的最佳方案。6.电子克隆的应用前景

将更容易的获得基因的染色体分布，结构，启动子、转录因子结合位点的信息，基因的鉴定和功能描述更加容易。

植物中除了拟南芥和水稻，很多EST数目较多的植物也可以利用EST的策略进行电子克隆，同时也可以间接的利用电子克隆的策略（更方便的文库筛选）。

电子克隆同样是发现新基因的重要途径。6.电子克隆的应用前景诚然，电子克隆的出现可以大大加速基因的分离和鉴定，但功能克隆（图位克隆、SSH等）的方法仍然是不可替代的，电子克隆可以大大加速和简化这些传统的基因分离途径。对于其他物种中已经充分鉴定功能的基因，电子克隆对于功能基因的分离利用，研究基因的结构、起源、分类和进化具有非常重要的意义。对于新基因，电子克隆仍然需要结合转基因等方法进行功能验证。小结什么是电子克隆？电子克隆的条件和特点；电子克隆的思路和具体例子；电子克隆中最常见的问题及解决办法；电子克隆中常用的生物信息学软件和网站介绍；电子克隆的应用前景;内容提要：问题:什么是电子克隆?什么是contig?给你一个小麦基因的蛋白序列,希望你能分离水稻的同源基因,