Ch3细胞分离技术

Chapter3CellDisruption

第三章细胞破碎技术2生物分离过程的一般流程本章内容主要内容第一节细胞破碎三、各种破碎方法的评述和选择依据一、细胞破碎方法总表

二、细胞破碎方法第二节胞内产物的溶解和复性第一节细胞破碎技术一、细胞破碎方法总表

一、细胞破碎方法破碎方式（是否受外加作用力）机械破碎法

非机械破碎法

固体剪切液体剪切高速珠磨法高压匀浆法超声波溶胞作用

脱水作用真空干燥空气干燥冷冻干燥溶剂干燥

物理的化学的酶的

渗透压冲击冻结融化法阴阳离子抗生素等溶菌酶等

细胞悬浮液与极细的研磨剂（D＜1mm的无铅玻璃珠）在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间，珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。1、珠磨法（High-speedbeadmill）

（1）破碎机理：（一）机械破碎法ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机WSK卧式高效全能珠磨机Crushinginballmill珠磨法S为破碎率，k为破碎速率常数，主要与磨珠的大小、搅拌速度、搅拌浆的形状、流量、细胞浓度、装珠量及温度等有关。

（2）动力学方程（一级反应方程式）：Ln（）=ktt=（3）温控与能耗：

珠磨机采用夹套冷却的方式实现温度控制的能耗与细胞破碎率成正比珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。（4）适用范围:2、高压匀浆法（Highpressurehomogenization）

由高压泵和匀浆阀组成。从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙喷出，速度可达几百米每秒，这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出，细胞在高速造成的剪切力、碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造成细胞破碎。（1）原理：大、中、小型高压匀浆器高压匀浆机采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国Microfluidics公司均有产品出售）。（2）细胞破碎率：属于一级反应速率方程S:细胞破碎率K:破碎速度常数(破碎的阻力)P:操作压力N:循环操作次数a、b指数因细胞种类和培养条件而异

细胞破碎的程度与温度、压力大小、匀浆次数、进料细胞悬浮液的浓度以及悬浮体系等有关，并呈线性关系。破碎的动力学方程:LnS=kPaNb总之：微生物形态（morphology）和生理状态（physiology）决定了细胞的机械强度，破碎的参数Rmax、k、a、b、ρ等，随细胞种类和培养条件的不同而有所差异。如指数a2.9(酵母)a=2.21（E.Coli）

1.77（产朊假丝酵母）

b、指数与细胞浓度和培养条件（如稀释率）有关。

活性物失活与产生热有关系，一般需多级操作，每次循环前要进行级间冷却。

能耗：提供动力（ρ）+低温维持的耗费（3）温控与能耗：在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法。（4）适用范围:适用于酵母和大多细菌细胞的破碎,不适用于……（5）高压匀浆法与高速珠磨法的特点的比较：

①操作参数②循环次数

③温控和能耗④使用范围1、机理：2、影响因素：3、适用范围：3、超声波破碎（ultrasonication）利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。

超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能、液体温度和粘度、处理时间等有关。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。Ultrasonication超声波超声波破碎仪

超声波清洗器(DL-720D)DL型系列超声波清洗器除其本身具有高效，高质量的清洗功能外，还具有“脱气”、“提取”、“乳化”、“加速溶解”、“粉碎”、“分散”等多种功能。产品广泛应用于各种需要清洗的物品。

SonicsVC750/VC500超声波破碎仪适用于多种研究领域之多用途多功能的超声破碎仪，它可处理由几微升到多达几百升的有机和无机样品，能够破碎各类细胞、细菌、孢子、组织，又可以打碎聚合物，乳化样品，溶解难溶物质，加速反应，雾化液体，分散颗粒，制备样品，气化液体及清洗技术。1、化学渗透（Chemicalpermeation）某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。（二）非机械破碎法TritonX-100牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠（1）表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。（2）EDTA螯合剂能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。（3）有机溶剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。不足：

易引起生化物质的变性，须在低温下操作，带来分离、回收化学试剂的问题。如苯、甲苯、抗生素、SDS、EDTA、变性剂（盐酸胍脲）等化学药品可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物质选择地渗透出来这种处理方式称为化学渗透法自溶作用。

作用机理：应用：化学渗透与机械法比较的优、缺点:

①、②、③（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等2、酶溶法（Enzymaticlysis）：原理外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、β–1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的β一l，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解。对于革兰氏阴性菌需辅以EDTA。真核细胞的细胞壁需采用不同的酶。蜗牛酶适于酵母细胞的处理（2）自溶法（Autolysis）诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。应用：用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，细胞工程常用的方法。酶溶法处理细胞存在的问题：①存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。②酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。③通用性差，不同的菌株用不同的酶。3、物理渗透法原理:适用范围:（2）反复冻结—融化法：机理：适用范围：（3）干燥法：（1）渗透压冲击法(Osmotichock):（1）目前在工业生产中应用最广泛的细胞破碎方法：有高压匀浆法和高速珠磨机法。（2）机械破碎法中存在的共同问题：（三）各种破碎方法的比较及选择1、主要破碎方法的比较（参见P39-40）（4）物理法：（5）干燥法：较剧烈的一种破碎方法。渗透压冲击、反复冻结—融化法。（3）非机械法中化学法和酶法应用最广泛：酶法自溶法抑制细胞壁合成的方法细胞的处理量和细胞壁的强度；目标产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性要达到的破碎程度及破碎所必要的速度等具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术把破碎条件和后面的提取步骤结合起来2、主要破碎方法的选择依据

在固—液分离中细胞碎片的大小是重要因素，太小的碎片很难分离除去，因此，破碎时既要获得较高的产物的释放率又不能使细胞碎片太小。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这三方面来权衡。选择的一般原则：A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法综合说明由于细胞之间及目标产物之间性质差异很大，已有的破碎理论、破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据。实际的破碎操作仍凭经验，即通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作参数，获得最佳破碎效率。提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标产物的变性或失活。机械法与酶法破碎的比较机械粉碎法：处理量大，破碎速度较快。细胞受到由高压产生的高剪切力，大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。选择合适的破碎方法需要考虑的因素：细胞的数量，目的产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；破碎程度及破碎速度等。

物理法和化学法的比较

物理破碎法缺点：A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；C、细胞碎片大小不一，难分离。

化学破碎法缺点：A、费用高；B、引起新的污染，尤其是其他化学方法；C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活每一步都应注意全面考虑操作度、对细胞的剪切程度、蛋白酶的失活作用等。在选择细胞破碎时也要考虑后面的各步。细胞破碎是为目标产物的释放创造条件，为了最大程度的获得活性产物，而不是最终目的。（包涵体的分离和蛋白质复性）第二节胞内产物的溶解和复性

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒，（inclusionbodiesIBs)。称为包含体一、包含体的概念及其形成：外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包涵体β-丙酰胺酶20%在细胞间区γ-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素>30%形成包涵体β-内酰胺酶形成间区包涵体人胰岛素原5%~26%形成包涵体2、包含体的形成：

一般认为包含体的形成是外源蛋白质在生成的过程中，缺少某些协助因子或者由于周围的物理环境（如I、T等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累成包含体。目标蛋白的复性

包含体（inclusionbodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体颗粒难溶于水，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中颗粒才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。以包涵体形式表达蛋白的优势①富含目的产物，有利于后续的分离纯化；②沉积于包涵体的目标产物不易被蛋白酶水解；③对于对宿主细胞有毒害或杀伤作用的目的产物，以包涵体形式表达有利。

细胞破碎离心细胞→→→胞匀浆液→→→包涵体