常用特殊染色技术及其质量控制

常用特殊染色技术及其质量控制徐开军云南省第三人民医院病理科1虽然免疫组化及分子病理学等技术的广泛应用，使得临床病理诊断不断提高，但作为传统的染色方法——特殊染色技术，仍在病理诊断中占有举足轻重的地位。特殊染色之所以一直未被取代：第一，取决于特殊染色本身的染色方法。操作简单、快捷、试剂价格低廉，无论是大、小医院病理科都是不可缺少的染色方法，相对于基层医院而言更为实用。第二，很多重要的特殊染色方法是其他染色方法都不能替代的。2

染色

规范化操作

方法的选择

质量控制

责任心

最基本的要素

染色的先决条件

染色结果的保证

染色方法的保证

特殊

3特殊染色的概念、意义特殊染色概念：为了显示组织或细胞内特殊成分，用特定的染液和方法对组织进行的染色。特殊染色意义：对于临床病理诊断及其鉴别诊断具有重要作用，是HE染色的补充，是不可缺少的染色技术。4特殊染色的特点特异性高（定性、定位、定量）操作方法简便染色时间较短试剂价格相对很低廉一些染色不可被替代5HE染色特染大部分特染免疫组化虽然目前免疫组化技术应用广泛，但是许多特殊染色是不可被免疫组化替代的。细菌、含铁血黄素、糖原、黏液……6

特殊染色多重的选择性1、一种染色方法染不同物质PAS染色：糖原、真菌、黏液……GMS染色：真菌、卡氏肺囊虫、基底膜……维多利亚蓝染色法：弹性纤维、乙肝表面抗原一种相同方法染不同物质？因含有相同物质，染色机制一致。真菌菌壁含多糖类物质，糖原属于多糖，所以PAS染色均呈红色。72、一种物质多种染色方法真菌：PAS染色法GMS染色法AB（pH2.5）染色法……神经髓鞘：变色酸2R染色法砂罗铬花青R染色法固绿染色法……83、一种染色方法多种复染方法含铁血黄素：核固红、中性红、伊红抗酸染色：美篮、苏木素胶原纤维：苯胺蓝、亮绿选择不同的背景复染方法，对于染色结果的判断会更加突出显示。9对于特殊染色多重的选择性，选择特异性的染色方法极为重要，选择的染色方法敏感性越高，对染色物质更加突出，而背景复染则决定了染色阳性结果对比的清晰度。含铁血黄素染色10虽然特殊染色有多重选择性，但也存在一定局限性。要能够较好的保存组织和细胞的形态结构，才能使得被检测物质定位准确。酸、碱性磷酸酶应该在4°C冰箱内固定，时间不超过24小时，否则酶活性就会减弱或消失，包埋的温度过高也会使得酶被破坏而消失。（冰冻切片能够较好保存酶）。证明组织中含有脂质的方法是冰冻切片。福尔马林在化学上能够改变一些脂质，特别是卵磷脂和缩醛磷脂，而且对中性脂肪没有作用，况且石蜡切片的脂质已经被溶解，不能做脂质染色。真正能固定脂质的溶剂只有锇酸。锇酸为剧毒品11对于绝大多数特殊染色的组织，选择10%缓冲福尔马林液固定能够达到很好效果。对于少数特殊染色组织需选择特定固定液：脂质（锇酸染色）—锇酸固定尿酸盐结晶—无水酒精固定肥大细胞—AF液固定特殊染色固定液的选择要求：1、固定液不能溶解细胞内物质2、使所显示的物质定位准确，不会出现移位现象特殊染色固定液12关于糖原的固定：以往显示糖原的组织常强调用无水酒精固定，主要是避免糖原溶解于水。个人见解，无水酒精对组织制片影响很大，组织会严重收缩、变形、变脆，及时固定在10%中性缓冲福尔马林液中糖原的损耗不会影响它的检测。但AFA液效果更佳。AFA液配制：95%酒精85ml，甲醛10ml，冰醋酸5ml固定兼脱水作用13

物理作用化学反应化学反应化学反应在染色过程中，染料与被染物之间既存在物理作用，又存在化学作用，是两者综合作用的结果。两者的结合着色过程非常复杂。特殊染色机制14常用特殊染色技术一、胶原纤维染色——Masson染色法二、网状纤维染色——氢氧化银氨法三、抗酸染色——苯酚碱性品红法四、真菌染色——PAS法五、淀粉样蛋白染色——刚果红法六、含铁血黄素染色——亚铁氰化钾法七、糖原染色——PAS法八、黏液染色——AB-PAS法九、脱黑色素法15一、胶原纤维染色——Masson染色法染液配制：1、Weigert铁苏木素：甲液：苏木素1g，无水酒精100ml；乙液：30%三氯化铁液4ml，蒸馏水95ml，盐酸1ml；使用前将两液等量混合。2、丽春红酸性品红液：丽春红0.7g，酸性品红0.3g，1%冰醋酸水溶液100ml。3、1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100ml。4、2%醋酸苯胺蓝液：苯胺蓝2g，冰醋酸2ml，蒸馏水98ml。5、亮绿液：亮绿1g，1%冰醋酸水溶液100ml。16染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、Weigert铁苏木素染5-10min。3、流水冲洗。4、1%盐酸酒精分化数秒。5、流水冲洗10min。6、丽春红酸性品红液10min。7、蒸馏水稍洗。8、1%磷钼酸水溶液处理10min。9、直接用2%醋酸苯胺蓝液或1%亮绿液复染5min。10、1%冰醋酸水溶液处理2min。11、95%酒精脱水3次。12、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。17染色结果：苯胺蓝复染时胶原纤维、软骨、黏液呈蓝色；以亮绿复染时胶原纤维、软骨、黏液呈绿色；肌纤维、红细胞、胞质、神经胶质呈红色，胞核呈黑蓝色。18注意事项及个人见解：1、Masson三色染色及VG染色用Weigert铁苏木素染胞核，其配制比较麻烦，且铁苏木素为醇溶性，在滴染时因酒精张力小，容易在玻片扩散，不易控制，可改用天青石蓝及Mayer苏木素代替，染色效果好，染色也可以保存较长时间。2、Weigert铁苏木素甲、乙液应于临用前等份混合，防止其氧化产生沉淀，甲液不宜配置过多，以免存放时间过长影响细胞核的着色。3、1%磷钼酸处理切片时，应在镜下观察控制染色时间，肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色或无色为宜。其对胶原纤维有媒染作用，有助于胶原纤维与亮绿或醋酸苯胺蓝的结合。4、1%冰醋酸作用在于分色，目的是除去附在原浆内的颜色，使得染色鲜艳和清晰。浓度范围为0.2%-1%。195、如在配制丽春红酸性品红液过程中没有丽春红，可直接用酸性品红替代，酸性品红0.3g改为1g即可。6、丽春红酸性品红染液和2%醋酸苯胺蓝染液性能较稳定，室温下一般可保存2年。7、胶原纤维染色也可选择方法较为简单的VanGieson染色法，但是VG染色因酸性品红易溶于水、苦味酸易溶于酒精，因此，VG染色后，经水、酒精都要迅速。但染色偏红时，可在水洗时延长时间，如果染色偏黄，可适当延长酒精脱水时间。8、为操作更简便，组织常规脱蜡至水后可直接滴加VG染液染色5-10min，染色后水速洗，烤干，封片。染色结果为细胞核不显色，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色。9、VG染色因酸性品红易褪色，可改用1%丽春红S代替。20应用：1、显示器官损伤、修复、纤维化程度：胃、十二指肠溃疡愈合时，胶原纤维染色溃疡底部可见纤维构成的瘢痕。2、作为判定某些肿瘤组织来源的依据：软组织梭形细胞肿瘤，既可以是纤维性的，也可以是肌源性的。早期肝硬化时的假小叶的形成，胶原纤维染色可见假小叶周围胶原纤维包绕。3、作为其他特殊染色的复染（VG）黑色素染色法、醛品红弹力纤维染色法VG染色21二、网状纤维染色——氢氧化银氨法（Gomori法）染液配制：1、Gomori银氨液：

用小量杯加10%硝酸银水溶液3ml，再加入10%氢氧化钾水溶液1ml，此时出现棕黑色颗粒沉淀，记下此时溶液的总量，加入10倍以上的蒸馏水洗涤沉淀物，然后吸去上层清液，再加入蒸馏水，如此反复洗涤3次，最后加蒸馏水至所记下的量。然后边滴加氢氧化铵边不断摇荡，直至沉淀物完全溶解。再加入10%硝酸银水溶液数滴至溶液稍变浑浊，再加入氢氧化铵一至数滴，使溶液再次变清。最后按原总量加蒸馏水10-15倍稀释，棕色玻璃瓶盛装于4°C冰箱保存。2、0.25%高锰酸钾液：高锰酸钾0.25g+蒸馏水100ml3、2%草酸液：草酸2g+蒸馏水100ml4、2%硫酸铁铵液：硫酸铁铵2g+蒸馏水100ml5、4%中性甲醛液：甲醛（40%）10ml+蒸馏水90ml22染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、0.25%高锰酸钾液氧化5min。3、自来水稍洗。4、2%草酸液漂白1-2min。5、自来水充分洗，蒸馏水洗。6、2%硫酸铁铵液媒染5min。7、自来水稍洗，蒸馏水洗。8、滴入Gomori银氨液作用3-5min。9、蒸馏水稍洗。10、4%中性甲醛液还原1min。11、流水冲洗5-10min。12、常规脱水透明，中性树胶封固。23染色结果：网状纤维—黑色胶原纤维—黄色至棕黄色细胞核—褐色24注意事项及个人见解：1、配好后的银氨液很敏感，受光或空气作用后均易解离析出银盐，故应用棕色玻璃瓶盛装并密封避光保存，一般置于4°C冰箱可保存4-8周。如见银盐析出，则需要重新配制。2、切片经4%甲醛液还原，流水冲洗后，放在显微镜下观察。如浸银过度，可用高锰酸钾液水溶液稍处理，再经流水冲洗；如浸银不足，可在流水冲洗后，再滴入银氨液染色1-2min，然后蒸馏水洗，4%中性甲醛还原，可获得满意效果。3、使用高锰酸钾氧化及草酸漂白处理时间不能过长，过长容易引起脱片。4、切片在经2%硫酸铁铵和银氨液染色后，水洗时间不能过长或过短，一般以数秒为宜，时间过长会减弱银的还原性，网状纤维不够黑，时间过短，又会使得银的还原性不够均匀。255、关于4%中性甲醛还原后采用0.2%氯化金调色和5%硫代硫酸钠固定以除去未还原的银盐，实际上省去这两个步骤对染色效果没有影响，长期保存也不会退色。6、配制银氨溶液时，氢氧化铵必须新鲜，用后及时密封保存。所滴加的氢氧化铵量必须严格控制，这是染色成败的关键。需精心操作，注意不能过量，应边加边摇动，加1滴后摇动片刻，一定要加至所形成沉淀物恰好溶解为止，不可多加。7、2%硫酸铁铵媒染时间如短于5min，核着色会偏很淡。26应用：1、癌与肉瘤的鉴别：癌：网状纤维包绕癌巢周围肉瘤：网状纤维分散包绕单个肉瘤细胞2、鉴别原位癌或早期浸润癌：原位癌：基底膜完整早期浸润癌：基底膜断裂崩解3、区分血管内皮瘤及血管外皮瘤：血管内皮瘤：网状纤维包绕在瘤细胞巢血管外皮瘤：网状纤维穿插在瘤细胞间淋巴结转移性中-低分化鳞状细胞癌27三、抗酸染色（苯酚碱性品红法）染液配制：1、碱性品红酒精液碱性品红5g+95%酒精100ml取小口砂塞瓶盛装，混合后轻轻摇动多次使其彻底溶解2、5%苯酚水溶液取苯酚置入约50°C的温箱使其溶解，量取5ml与蒸馏水95ml充分混溶。3、苯酚碱性品红液碱性品红酒精液10ml+5%苯酚水溶液90ml4、20%硫酸蒸馏水80ml+硫酸20ml5、汽油松节油混合液汽油+松节油=1:128染色步骤：1、切片在汽油松节油混合液中脱蜡2次，每次约5-10min。2、用吸水纸将切片周围脱蜡液擦干，但切片应保持湿润。3、温水、自来水洗3min。4、将切片置于盛有苯酚碱性品红液的立染缸内，置60°C恒温箱浸染30min。5、流水充分洗去多余染液。6、20%硫酸分化。7、流水冲洗5min。8、苏木素浅染胞核，1%盐酸分化。9、流水冲洗10min。10、50-60°C恒温箱中烤干，二甲苯透明，中性树胶封固。29染色结果：抗酸杆菌（包括结核杆菌和麻风杆菌）—红色细胞核—淡蓝色30注意事项及个人见解：1、染色时，应选用阳性切片作对照。2、分化可选择盐酸酒精，分化后切片经水洗应为淡粉色。3、复染可选择美篮，复染数秒后，在95%酒精内稍作脱色，否则会遮盖抗酸杆菌，造成对比不清晰。4、苯酚俗称石炭酸，为无色结晶。如呈红色，则是受到氧化，不应使用，配制5%苯酚水溶液时，先将整瓶苯酚置于60°C恒温箱中加热溶解，然后速取5ml加入95ml蒸馏水充分混合。5、染色后切片如果经苯酚二甲苯，则抗酸菌易脱色。6、以往苯酚碱性品红染色时都是用酒精灯直接加热染色，加热温度不易控制，染色结果也相对不稳定，切片上染液沉渣较多，易与抗酸杆菌混淆，加热不当切片易炸裂。可采用盛有染液的立式染缸染色，切片无污染，加热

温度均匀，染色结果清晰，也可在切片上滴加染液，放31入湿盒内，置于恒温箱中。染色时不能使切片干燥。7、采用汽油松节油混合液代替二甲苯和酒精，是为了保存菌体内的类脂质不受到高浓度酒精的破坏，使染色后出现细菌数量多及染色深，这对细菌少的标本更加有利。汽油松节油混合液要经常更换，确保脱蜡干净。8、因抗酸杆菌菌体内含有蜡质并形成完整的蜡样包膜，蜡质具有抗酸性，对酸、碱都有较强的抵抗力，一般染料难以渗入菌体内，可在苯酚碱性品红液内加入适当的5%-10%的TritonX-100或5%-10%的Tween-20表面活性剂，来增加一定的渗透力。9、表面活性剂的量为：碱性品红酒精液10ml+5%苯酚水溶液85ml+活性剂5ml，用前过滤，其染色切片置于盛有染液的立式染色缸内，60°C恒温箱中30min。10、用强酸进行脱钙可能会破坏抗酸性，最好使用甲酸脱钙。32应用：结核病与类结核病及麻风病的诊断与鉴别诊断：结核病：抗酸染色（+）麻风病：抗酸染色（+）瘤型麻风：找到大量麻风杆菌类结核型麻风：找不到麻风杆菌结核杆菌：细长、稍弯曲，长短不一，常单条散在分布麻风杆菌：较粗短、笔直，常呈束状排列或聚集成堆肺结核33四、真菌染色（PAS法）染液配制：1、0.5%高碘酸水溶液：高碘酸0.5g+蒸馏水100ml2、无色品红（Shiff试剂）：先将1g碱性品红溶于80°C的200ml蒸馏水，再加热沸腾片刻，并充分搅拌5min，冷却至50°C时过滤，将20ml1mol/L盐酸加入滤液内。冷却至25°C时加入偏重亚硫酸钠1-1.5g，立即用塞紧瓶口。将溶液存放在暗处或冰箱内12-24小时后，此时溶液呈淡土黄色，再加入2g活性炭，震荡溶液1min后过滤。溶液呈无色、清澈、透明状态。用棕色瓶盛装于4°C冰箱保存。3、0.5%偏重亚硫酸钠液：偏重亚硫酸钠0.5g+蒸馏水100ml4、亮绿水溶液：亮绿0.2g+蒸馏水99.8ml+冰醋酸0.2ml34染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、0.5%高碘酸氧化5-8min。3、流水冲洗2min，再用蒸馏水洗。4、入无色品红液于暗处并加盖作用10-20min。5、0.5%偏重亚硫酸钠滴洗3次，每次2min。6、再流水冲洗5min。7、亮绿水溶液复染数秒。8、流水稍洗。9、常规脱水透明，中性树胶封固。35染色结果：真菌—红色组织—绿色36注意事项及个人见解：1、在配制过程中所用的玻璃器皿要求十分干净，一般要用硫酸洗液浸泡过。2、不能在蒸馏水沸腾的时候加入碱性品红，防止沸腾的水蒸气把碱性品红液喷溅出来3、无色品红液要放在4°C冰箱保存，临用前半小时取出恢复到室温，用后可倒回原瓶内放回放冰箱内保存，可如此反复使用多次，至溶液出现淡红色时才倒弃。4、无色品红染色时需加盖暗处染色，染色时间随室温而定。室温高一般作用10min已足够；室温低，可延长作用时间至20min左右或者在25°C左右水浴箱中染色，但不可超过30°C。5、高碘酸水溶液和偏重亚硫酸钠于4°C冰箱保存，可使用数月，临用前取出恢复至室温，高碘酸的氧化力度比其他氧化剂优越，它不把所形成的醛基进一步氧化。376、无色品红染色后用偏重亚硫酸钠漂洗以减少背景的着色，实际上用流水充分洗涤也能得到很好的效果，可以省略偏重亚硫酸钠漂洗的步骤。7、高碘酸的浓度一般在0.5%-1%之间，pH多在3-5之间。另外其作用的温度过高或时间过长可出现假阳性反应，温度以不高于20°C为宜，时间以5-10min为妥。8、无色品红液染色过程中，加入5%的次氯酸钠溶液可以减少污染。9、无色品红在使用一段时间后，颜色渐渐变成淡红色，染色力度下降，一般应该倒弃重新配制新液，不过，在每100ml变为淡红色的液体中加入0.7-0.9g偏重亚硫酸钠，染色力度即可增加，效果很好。10、0.5%偏重亚硫酸钠漂洗后可用苏木素或者亮绿复染，实际上不行复染也可以。38应用：致病性真菌常见有毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、白色念珠菌、马尔尼菲青霉菌等，特殊染色对其病理诊断有非常重要的作用。鼻窦真菌病39五、淀粉样蛋白染色（刚果红法）染液配制：1、刚果红染液：刚果红0.2g+50%酒精100ml2、碱性酒精分化液：氢氧化钾0.2g+80%酒精100ml40染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、刚果红染液染10min。3、自来水稍洗。4、用碱性酒精分化1-2min；5、苏木素浅染胞核。6、盐酸酒精稍分化。7、流水冲洗10min。8、常规脱水透明，中性树胶封固。41染色结果：淀粉样蛋白—橘红色细胞核—蓝色42注意事项及个人见解：1、碱性酒精分化是染色的关键，若分化不足，胶原纤维也被着染，分化过度，淀粉样蛋白也被脱色。如果分化过度，可将切片水洗后再加刚果红染液重新染色。最好在显微镜下观察分化。2、凡是用刚果红染淀粉样蛋白，不管用哪个方法，都能把甲状腺胶质、弹力纤维染成红色，根据形态上的不同，应该注意区别。3、最好用浸染法，因在滴染时溶液容易扩散，若滴染放入湿盒内为佳，避免溶液挥发、扩散引起切片干燥。4、也可使用甲醇刚果红法染色，因为甲醇能更好的溶解刚果红，甘油则可防止甲醇的挥发，同时使刚果红染液稳定，能保存使用较长时间。43应用：1、区分淀粉样变性与其他变性：胶原纤维和网状纤维周围、小动脉、血管外膜等出现病变时，淀粉样物质染色可显示和区分其病变的性质。2、为某些疾病的诊断与鉴别诊断提供依据：钙化上皮瘤、声带息肉、前列腺常出现淀粉样变性，可为诊断提供依据。3、用于肿瘤的诊断和鉴别：特别是内分泌性肿瘤，间质内常出现淀粉样物质沉着，如甲状腺髓样癌、胰岛细胞瘤、肺小细胞癌等，淀粉样物质染色阳性可作为诊断的依据。声带息肉44六、含铁血黄素染色（亚铁氰化钾法）染液配制：1、2%亚铁氰化钾水溶液：亚铁氰化钾2g+蒸馏水100ml2、2%盐酸水溶液：纯盐酸2ml+蒸馏水98ml临用前将2%亚铁氰化钾与2%盐酸等量混合即为工作液，即配即用。3、核固红染液：核固红0.1g+硫酸铝5g+蒸馏水100ml+麝香草酚50mg。45染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、蒸馏水充分洗。3、亚铁氰化钾工作液滴染15-20min。4、蒸馏水洗。5、核固红复染细胞核5-10min。6、稍水洗。7、常规脱水透明，中性树胶封固。46染色结果：含铁血黄素—蓝色细胞核—红色47注意事项及个人见解：1、盐酸以分析纯较好，因为粗制盐酸含铁较多，可导致染色出现假阳性。2、铁反应前各步骤均用蒸馏水洗，防止自来水中的铁离子与组织中的钙盐结合产生假阳性反应。3、2%亚铁氰化钾水溶液和2%盐酸水溶液用前混合，只能使用一次。4、含铁血黄素不溶于碱和有机溶剂，而可溶于酸。在5%的草酸中2-6小时可将含铁血黄素溶解。5、应避免使用酸性固定剂及铬酸盐固定液，选用中性缓冲福尔马林固定为佳。6、每次配制染液时尽可能少配制，新配制的染液呈无色清液，当变为淡蓝色时重新配制为佳。48应用：1、证明和鉴别含铁血黄素与其他色素：与黑色素、脂褐素等鉴别。2、显示组织内各种出血性病变：长期的肺淤血和出血（在肺泡内可见到含有大量含铁血黄素的所谓心衰细胞）、出血性病灶等。肩部真皮纤维瘤49七、糖原染色（PAS法）染液配制：1、0.5%高碘酸水溶液：2、0.5%偏重亚硫酸钠水溶液：3、无色品红液（Schiff试剂）：均同“真菌染色”4、1%淀粉酶（或唾液）：淀粉酶1g+蒸馏水100ml50染色步骤：1、取两张连续切片，分别标记待测及消化对照。2、将消化对照切片脱蜡至水。3、把消化对照切片放入预热至37°C的1%淀粉酶液，于37°C温箱内消化1小时，或用预热至37°C的唾液在37°C温箱消化30min，取出切片稍水洗。4、在消化对照切片处理过程中，将待测切片脱蜡至水，将两张切片同时滴入0.5%高碘酸水溶液氧化10min，蒸馏水充分洗。5、入无色品红液于暗处并加盖作用10-30min。6、用0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗3次，每次约2min，流水冲洗5-10min。7、苏木素复染胞核，盐酸酒精稍分化，自来水洗。8、常规脱水、透明，中性树胶封固。51染色结果：糖原—红色-紫红色细胞核—浅蓝色经过消化糖原—无色52注意事项及个人见解：1、糖原染色必须做消化对照，这是关键的前提条件。2、PAS阳性物质主要有糖原、甲状腺滤泡胶质、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮分泌的黏液、真菌、纤维蛋白等，均呈紫红色。3、糖原消化物质为：淀粉酶与唾液，淀粉酶存放过久，容易失效，唾液的消化作用效果较好。4、唾液的制备：收集自己的唾液约1ml，加蒸馏水稀释，混匀。也可直接用不稀释的唾液。5、着色深浅在一定程度上依赖于高碘酸及无色品红试剂作用时间的长短。对于基底膜，时间适当延长，高碘酸

10min，无色品红作用20min结果会更好。6、偏重亚硫酸钠或钾盐均可使用，但质量要纯。537、用高碘酸氧化，无色品红反应，天青石蓝和Mayer苏木素染胞核，再用橙黄G复染，称为PAS三色法，也特别适用于鉴别脑垂体的三种细胞（嗜碱细胞颗粒呈紫红色，嗜酸细胞颗粒呈橙黄色，嫌色细胞浅灰蓝色或无色）。关于PAS染色：PAS染色是一种常用而很有价值的特殊染色方法。通过检测黏蛋白或糖原对肿瘤的鉴别诊断有很大帮助。无色品红染液对基底膜内糖蛋白的反应使PAS染色成为评估基底膜厚度的重要方法。基底膜厚度（尤其是肾小球毛细血管内）增加表明存在病变。PAS染色也是显示组织中真菌的一种敏感而相对快速的方法，因为许多真菌的荚膜或细胞壁上存在高碘酸反应性多糖。常见的PAS反应性真菌包括：白色念珠菌、组织胞浆菌、隐球菌等。54应用：1、证明空亮的胞浆为糖原还是脂质。2、糖原贮积病和糖尿病的诊断：糖尿病时，肝细胞内出现大量糖原（也可见于核内，称为核糖原）。3、某些肿瘤的诊断与鉴别诊断：骨尤文氏肉瘤（+）骨恶性淋巴瘤（-）……肝脏低分化腺癌55八、黏液染色（AB-PAS法）染液配制：1、爱尔新蓝染液：爱尔新蓝8GX1g+蒸馏水97ml+冰醋酸3ml2、0.5%高碘酸水溶液：3、0.5%偏重亚硫酸钠水溶液：4、无色品红液（Schiff试剂）：均同“真菌染色”56染色步骤：1、切片常规脱蜡至水。2、3%醋酸液3min。3、爱尔新蓝液染10-30min，蒸馏水充分洗。4、0.5%高碘酸液氧化5-10min。5、蒸馏水充分洗涤。6、入无色品红液于暗处并加盖作用15-20min。7、0.5%偏重亚硫酸钠滴洗3次，每次2min。8、流水洗5-10min。9、苏木精染核，盐酸酒精稍分化，自来水洗。10、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。57染色结果：酸性黏液物质—蓝色中性粘液物质—红色中性和酸性粘液混合物—紫色细胞核—浅蓝色58注意事项及个人见解：1、在爱尔新蓝染液前用3%冰醋酸水溶液浸泡切片是为了保证爱尔新蓝染液pH的稳定性。此步骤可以省略。2、爱尔新蓝染色含有3%冰醋酸，以使其pH为2.5。可加入50mg麝香草酚防止真菌的生长，配制后放入冰箱可保存使用约1年。3、苏木素淡染非常重要，目的是防止胞浆或黏蛋白着色而掩盖爱尔新蓝的颜色，或者可省去不染核。59应用：1、胃黏膜肠上皮化生：AB-PAS染色胃黏膜表面上皮（分泌中性黏液）呈红色，而肠杯状细胞和肠腺（分泌酸性黏液）呈蓝色。2、肠癌肝转移与原发性肝细胞肝癌鉴别诊断：肠癌肝转移AB-PAS染色呈阳性（PAS染色时须对照鉴别），原发性肝细胞肝癌PAS阳性、AB染色阴性。肝脏转移性低分化腺癌603、Barrett食管胃黏膜异位，AB-PAS染色呈红色4、胃黏膜癌变时，细胞黏液变为酸性低分化腺癌、印戒细胞癌胃印戒细胞癌61九、脱黑色素法1、酒精氨水法：70%酒精50ml，浓氨水1ml将石蜡切片脱蜡至水，放入此液中5min，再用自来水冲洗10min即可。2、酒精氢氧化钾法：70%酒精50ml，1%氢氧化钾2ml将石蜡切片脱蜡至水，放入此液中5min，再用自来水冲洗10min即可。3、高锰酸钾草酸法：0.5%高锰酸钾水溶液，2%草酸水溶液将石蜡切片片脱蜡至水，0.5%高锰酸钾水溶液浸泡10-20min，水洗后用1%草酸水溶液漂白。62染色结果：黑色素被脱色63注意事项及个人见解：1、高锰酸钾水溶液以新配为佳，太陈旧的氧化力弱，脱色效果也随之欠佳。2、酸化高锰酸钾水溶液脱色效果较好，但是高锰酸钾氧化及草酸漂白处理时间不能过长，过长可使切片脱落。切片在4-5um为佳，过厚也容易脱片。64关于免疫组化染色之前脱黑色素的方法：可按照处理常规染色方法进行处理，时间应该调节好，须细心操作，防止切片在免疫组化染色抗原修复过程中脱片。千万不可在DAB显色复染之后进行高锰酸钾脱黑色素及草酸漂白关于免疫组化染色后区别黑色素的复染方法：1、按照免疫组化染色步骤操作，至DAB显色后，水洗。2、滴加Giemsa工作液，20-30min，自来水洗。3、1:500（1ml冰醋酸+500ml蒸馏水）冰醋酸分化，至黑色素呈绿色为止，显微镜观察4、水洗后常规脱水、透明及封固。65特殊染色结果判读所选择染色方法表达结果、对照染色的结果、生物学形态。结合三者判断，才是可靠的结果。1、特殊染色方法多重选择性，所选择染色方法结果阳性表达结果，定位清晰准确。2、染色结果必须建立在组织阳性对照或内对照有效的基础上。3、判断染色结果时，应准确认识生物学形态。66肝糖原染色：所选择方法：PAS法对照：糖原阴性生物学形态：细胞质内，颗粒状内对照67真皮纤维瘤含铁血黄素染色：所选择方法：亚铁氰化钾法对照：阳性生物学形态：金黄色或黄棕色大小不等颗粒阳性对照68特殊染色质量控制1、阳性对照2、阴性对照3、内对照1、方法的选择2、染液配制后的验证3、染液的保存1、染色掌握2、染色性质了解染色控制染色液配制、保存对照的设立结果质量控制69一、对照的设立对照是首要条件可确保染色试剂的有效、染色方法的可靠、操作的规范最终证实染色结果的可靠701、阳性对照已知含有所染色物质的标本病原微生物的染色中，设立阳性对照是非常有必要的，原则上缺阳性对照的染色结果不能作为诊断结果。712、阴性对照已知不含有所染色物质的标本一般来讲，特殊染色阳性结果比阴性结果更有意义。阴性结果可能缘于许多因素，可能源于固定液对组织的影响、物质含量低、组织处理时的影响、染色方法不敏感或操作有误等引起的。723、内对照阻断或消化的方法组织自身物质消化对照糖原：单纯多糖，功能结构与植物淀粉相似，故又称动物淀粉。PAS染色，淀粉酶或唾液消化处理。对照片经消化后PAS染色阴性是糖原。73自身对照真菌鼻窦真菌病PAS染色，组织腺体分泌黏液物质呈红色作为最佳对照。74二、染色液配制、保存染色液的配制对于染色至关重要网状纤维染色银