生化实验技术与方法

糖的薄层层析

实验目的学习和掌握薄层层析的原理和方法实验原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。

层析法的分类按机理分类：吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。

实验操作硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。1.2g硅胶H加4.0ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。硅胶G硅胶H硅胶GF254硅胶HF2542.板的处理：薄板的活化：105℃，0.5h

薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。5.显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。20mm10mm30mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取纯化

实验目的掌握分离纯化酶的基本操作和方法。实验原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。

离子交换层析法主要是利用溶液中各种带电离子与离子交换剂之间的结合力的差异进行的分离方法。各种氨基酸分子的等电点不同，在同一pH时所带电荷不同，与离子交换树脂的结合力有差异，因此可依据结合力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。离子交换剂为固定相。带电离子与离子交换剂之间的作用力主要是静电力，它们的结合是可逆的。

离子交换剂由基质（惰性不溶性载体）、电荷基团（功能基团）和反离子（平衡离子）三部分组成。纤维素-O-CH2-COO--Na+

基质电荷基团反离子离子交换剂的种类

（一）按载体种类不同1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂2.离子交换纤维素3.离子交换凝胶（二）按功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂—功能基团带负电荷（平衡离子带正电荷），与阳离子交换。阴离子交换剂

—功能基团带正电荷（平衡离子带负电荷）

，与阴离子交换。

聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（单体）和苯二乙烯（交联剂）进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的高聚物。它是离子交换树脂的基质，带电基团是通过后来的反应引入基质的，树脂一般都制成球形颗粒。

—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—SO3—

—CH—CH2—CH2—CH—苯环—SO3—有氢型和钠型H+或Na+H+或Na+从交换剂上洗脱目的物的方法有两种：1.调节洗脱液的pH，使目的物在此pH下失去电荷甚至带相反电荷。2.用高浓度的同性离子，将目的离子取代下来。仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统等试剂0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）固体硫酸铵0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）缓冲液）；DEAE纤维素52操作步骤酶的提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。（2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样0.5ml。硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L)（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样0.5ml。透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样0.5ml。银杏叶2g+10ml酶提取液研磨4000rpm、30min取上清液加硫酸铵至饱和度38%

9000rpm、15min取上清液加硫酸铵至饱和度75%

9000rpm、15min取沉淀溶于2ml酶抽提液透析纯化离子交换层析DEAE纤维素（1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。（2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用2~3个床体积的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）洗脱平衡该柱。（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）2~3cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4）洗柱：用A液（0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））及B液（含1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））洗柱，流速为1mL/min，3ml/管,紫外检测仪检测，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。苯丙氨酸解氨酶的活力测定

实验目的学习苯丙氨酸解氨酶活力测定方法。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。实验原理取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）

将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时在待测管（1号）加0.2ml2mol/LHCl终止反应。紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。操作步骤蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml取试管8支，按下表加入各溶液：将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。

PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS－PAGE）测定蛋白质分子量

实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS－PAGE）测定蛋白质分子量

原理：SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。SDS是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。

SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1.由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMr，再换算成蛋白质分子量．

在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。操作如同PAGE。样品：蛋白质要完全变性。蛋白质+SDS+巯基乙醇100℃2-5分钟标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。染色：考马氏亮蓝、银染色该法测定蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。2.电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）实验操作

胶的制备样品的处理：按4:1的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室