高三生物一轮复习课件 【备课精研+高效课堂】基因工程的基本操作程序

DNA重组技术的基本工具“分子运输车“”分子手术刀““分子缝合针”例如：培育转基因抗虫棉的简要过程提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序：获：目的基因的筛选与获取构：基因表达载体的构建导：将目的基因导入受体细胞检：目的基因的检测和鉴定（核心）一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变_______________或获得_______________等的基因。受体细胞性状预期表达产物(2)实例：与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等主要指编码蛋白质的基因。2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的______________和____________的基因中进行筛选。(2)实例：已知结构功能清晰Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。相关信息：Bt抗虫蛋白的抗虫原理：思考讨论：抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据__________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列提取苏云金杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的缩写，它是一项根据__________________的原理，在体外提供______________的各种组分与反应条件，对_____________________进行大量复制的技术。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列①全称：②原理：③操作环境：④目的：⑤优点：聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制短时间内大量扩增目的基因耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）PCR条件:四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶3．利用PCR获取和扩增目的基因注：引物是一小段能与________的一段碱基序列________的___________。

用于PCR的引物有

种，长度通常为20~30个核苷酸。DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物2

3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链PCR反应过程：3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的筛选与获取(3)利用PCR获取和扩增目的基因第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物③PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取PCR反应的过程动画：受热变性引物

耐高温的DNA聚合酶PCR技术

(1)过程：(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种_______、四种______________、____________________。引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶（3）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出

个DNA片段。指数2n【知识小结】PCR技术与生物体内DNA复制的比较比较项目生物体内DNA复制PCR技术

区别解旋方式场所酶温度条件合成对象解旋酶催化细胞内(主要在细胞核内)DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等细胞内温和条件DNA分子DNA在高温作用下变性解旋细胞外(在PCR扩增仪内)耐高温的的DNA聚合酶(Taq聚合酶)需控制温度，在较高温度下进行DNA片段或基因联系①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成②原料：均为四种脱氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶进行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸PCR技术与生物体内DNA复制的比较用PCR可以直接扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？——核心步骤1．基因表达载体构建的目的：二、基因表达载体的构建确保目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且能遗传给下一代。2．基因表达载体的组成：限制酶切割位点启动子终止子质粒复制原点标记基因便于重组DNA分子的筛选目的基因、标记基因、启动子、终止子等位置:位于基因的下游功能:终止转录本质:有特殊序列结构的DNA片段位置:位于基因的上游功能:是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA本质:有特殊序列结构的DNA片段——核心步骤二、基因表达载体的构建目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子重组DNA分子限制酶3.基因表达载体的构建过程目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？【典例】如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(

)BA.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC.图示过程是基因工程的核心步骤D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中；作用：起始和终止转录过程。起始密码子与终止密码子位于mRNA分子中；作用：起始和终止翻译过程。三、将目的基因导入受体细胞（一）导入植物细胞农杆菌转化法花粉管通道法(最多)

导入方法1.花粉管通道法：我国科学家独创①用___________将___________________直接注入____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定时间内，剪去____，将________滴加在________上，使目的基因借助___________进入_____；柱头DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受体细胞：受精卵子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊③花粉管通道法的过程：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程2.农杆菌转化法①转化：②农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染___________和_________，而对大多数___________没有侵染能力；双子叶植物裸子植物单子叶植物b.农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将______上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入_____________中，通过农杆菌的_____作用，就可以使目的基因___________③利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA转化进入植物细胞（一）导入植物细胞④农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入⑤转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；受体细胞为_______体细胞b.可以将____直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得____，再进行筛选、鉴定等；受体细胞为_______花序种子受精卵2.农杆菌转化法（一）导入植物细胞——显微注射法1.受体细胞：受精卵。(因为受精卵容易表现出全能性)2.过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物（二）导入动物细胞（转基因动物)——Ca2+处理法1.受体细胞：

常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。2.原核生物的优点:

繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。3.过程:2023/2/7Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中（Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性）（感受态细胞）（三）导入入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法;花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法(感受态细胞法)受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞小结：将目的基因导入受体细胞(1)花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。()解析：农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和裸子植物。(2)农杆菌侵入植物细胞后，其Ti质粒上的T－DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。()(3)培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。(

)(4)将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。(

)×√√√【基础过关】【典例】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是(

) A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物

解析：目前我国的转基因抗虫棉是利用花粉管通道法培育的，A正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使大肠杆菌处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最为有效的一种方法，C正确；农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，D错误。D【检测】菊花是一种双子叶植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长，还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长。某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述错误的是(

)A．受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞B．将目的基因GNA插入到Ti质粒的T­DNA上构建表达载体C．菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞D．应用抗虫接种实验，检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度A1、目的基因的筛选与获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作的四个步骤思考：将目的基因成功导入受体细胞后，为什么还要进行目的基因的检测与鉴定？

检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性；目的:（一）检测内容及方法:类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状病原体接种实验等四、目的基因的检测与鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质—

抗原-抗体杂交蛋白质（抗原）提取苏云金杆菌Bt抗虫蛋白提取抗体出现沉淀转基因抗虫棉说明转基因抗虫棉表达出了Bt抗虫蛋白抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平鉴定（二）鉴定——转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常(1)常使用PCR等技术，从分子水平上检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否转录出mRNA。()(2)从分子水平上检测目的基因是否翻译出相关蛋白质的方法之一是利用抗原—抗体杂交技术。()(3)可以通过盐碱地栽培试验