微生物学常用技术

微生物学常用技术第一页，共七十五页，2022年，8月28日第2讲微生物实验技术（1）第二页，共七十五页，2022年，8月28日内容提要微生物实验最基本的原理与微生物培养的主要工作(ThefiveI’s)发酵工程菌种保藏显微术第三页，共七十五页，2022年，8月28日？讲在课前……作为一名学生，是否应该接受老师的权威表述？你的回答是什么？

Yes?这当然是正确的，因为每一位教师在教学中所说的每一件事都是经过考证、研究证明是新的，合理的。这个课堂的学习，最终应该让大家学习到这个学科研究的知识框架，了解当代微生物学知识的一个全景……第四页，共七十五页，2022年，8月28日了解如何进行微生物的操作很重要？但是，这种依据是否过于简单？你的这个“是”，是否还应该加上一些附加条件？比如对这些知识的得来有个基本的认识？在一个依赖于高度发达的技术的社会，作为一个普通的人要以批判的眼光去看待科学研究的结果，正确判定哪些应该是大家公认的，而哪些可能是冒险。哲学的说法即：要有证伪的态度与能力—真理只能被证伪而不能被证实。必须具备相应的知识，并能对新出现的知识有正确的评判。第五页，共七十五页，2022年，8月28日卡尔·波普尔—著作《猜想与反驳》——提出科学和非科学划分的证伪原则。证伪主义使人们相信所有的科学都只是一种猜测和假说，它们不会被最终证实，但却会被随时证伪。最好的假说是终极真理的代名词，和科学精神相悖。——偶然真理：经验科学应该服从一种证伪主义。应采用试错法。这是指人们应该大胆地提出假说和猜测，然后去寻找和这一假说不符合的事例。根据事例对假说进行修正，不断重复这一过程，乃至将最初的假说全盘否定。试错法对理论的修改和完善是没有止境的，试错法的结果只能是一个较好的假说，但不是最好的假说。第六页，共七十五页，2022年，8月28日卡尔·波普尔—著作《猜想与反驳》——证伪主义至少存在两个优点。第一，科学理论的表达一般为全称判断，而经验的对象是个别的。所以，经验如果用来证实理论，那么它将是无法穷尽一般的理论的。比如，再多的白羊也不能证明所有的羊都是白的，而只要一只黑羊就能证明所有的羊都是白的这个理论是错误的。所以，经验的真正意义在于可以证伪科学理论。第二，证伪主义可以避免对错误理论的辩护和教条。如果坚持实证主义，那么一旦出现与理论相悖的经验，人们便会做出特殊的设定或限制以使得理论能满足经验。但实际上这样的设定往往是极不科学的。第七页，共七十五页，2022年，8月28日了解如何进行微生物的操作很重要？科学的精神—正是“通识”课程的本意：科学总是寻求发现和了解客观世界的新现象，研究和掌握新规律，总是在不懈地追求真理。科学是认真的、严谨的实事求事的，同时科学又是创造的，科学的最基本态度之一就是疑问，科学的最基本精神之一就是批判（-第一推动丛书，总序）。而如何才能做到这些呢？这就必须对学科的本源，实验原理和操作手段有所了解。第八页，共七十五页，2022年，8月28日实验由实验操作学习开始，会使学习更有兴趣，得到的知识更能记住。微生物学由此研究对象的独特性，其研究手段极具特色，并已经在生物科学技术领域得到广泛应用第九页，共七十五页，2022年，8月28日ThefiveI’s微生物实验最基本的原理PureCulture——微生物研究的基础第十页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学

最基本的理念与最基础的工作最基本理念（纯培养，无菌操作，群体研究）最基础的工作_培养基与分离纯化第十一页，共七十五页，2022年，8月28日根本原理-生命由“种子产生”在19世纪后叶，巴斯德的一个著名实验之后，一个基本的观念即被人们广泛接受：即生命物质不能由非生命物质产生。(实验是什么？)在一个巧妙设计的容器中装入灭过菌的肉汤，并能接触空气和保温，而又不使生活在空气中的微生物进入。--------20世纪60年代，在伦敦皇家研究所还能见到19世纪后期保存的那些约翰·丁德尔配制的陈年肉汤。第十二页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学研究面临的几个问题微生物群体是形形色色的”大杂烩“Mosthabitats(suchasthesoilandthehumanmouth)harbormicrobesincomplexassociations.研究通常只能在实验室“人工”环境开展Second,tomaintainandkeeptrackofsuchsmallresearchsubjects,microbiologistsusuallyhavetogrowthemunderartificialconditions.“感杂”必需防止Athirddifficultinworkingwithmicrobesisthattheyareinvisibleandwidelydistributed,andundesirableonescanbeintroducedintoanexperimentandcausemisleadingresults.第十三页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学实验最基本的理念（1）灭过菌的物质在适当条件下将保持无菌状态，除非有人去感染它!这就是微生物学最基本的原理。（2）当我们制备出灭菌的肉汤，用单一的品种去感染，可以保持微生物的“纯一”-微生物培养物。第十四页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学实验室最基本的理念……微生物学研究的基础是必须首先想法培育出不被从另处而来的微生物污染(感染)的纯一的种系。微生物学研究技术在整体上与生物学其它领域的技术有明显的区别。你可以抓住一条狗、一株植物，用各种方式，想各种办法去观察它们，但你目前不能对某个单个的微生物进行这些工作!（3）群体研究微生物学家们的研究策略，同化学家们一样(化学家们总是从对成千上万个分子而非单一分子研究中得到信息)，研究对象通常是群体。第十五页，共七十五页，2022年，8月28日可见，微生物实验室最基本的要求是必须做好微生物的控制。让我们认识其中几个基本的概念：

Sterile(灭菌),relatestothecompletelyabsenceofviablemicrobe;Aseptic(防腐),relatestopreventionofinfection;Pureculture(纯培养)referstogrowthofasinglespeciesofmicrobes.微生物学实验室最基本的理念第十六页，共七十五页，2022年，8月28日工作的基础：无菌技术无菌技术:容易想到,要取得纯培养的成功，必须做到培养基的组成必须适合微生物的需要，而且培养基、玻璃器皿、器械也一定要是无菌的。此外，在操作中要把被来自空气里微生物污染的可能性减少到最小(感杂）。微生物学上把这种技术叫做无菌技术。无菌操作技术已经成为高端生物技术的基本要求（生物发酵，组织培养，胚胎克隆，干细胞研究……）。第十七页，共七十五页，2022年，8月28日微生物实验室风淋室第十八页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学最基础的工作——CULTURE（1）培养基：微生物学上的培养基，即微生物可以在其内部或是表面生长的一种“汤”或是胶冻。其中含有微生物生长所需要的少量铁、镁、磷、钠、钾、钙等元素、铵盐的氮源及某种碳化合物。试想：如果你有这样一杯“肉汤”，用1克土去感染这种溶液，会有什么结果？第十九页，共七十五页，2022年，8月28日一杯肉汤的故事我们相信，在自然的任何一口水池、一片沼泽……类似的故事，正在不断重复。我们是一群土壤细菌，小杆状身姿最大方！好氧菌首先生长，氧化糖类而迅速耗尽氧气厌氧菌如梭菌等生长于深层，产生恶心臭味。并有二氧化碳释放（厌氧呼吸）接下来是硝酸盐呼吸！硫酸盐呼吸如果有甲烷球菌，则它们是笑到最后者（碳酸盐呼吸）早就告诉过你们，圆才是永恒的！地球不都是圆的吗？第二十页，共七十五页，2022年，8月28日纯培养pureculture，axenicculture纯培养：单一种类存在的状态下所进行的生物培养。所有微生物、植物和动物都可以进行这种培养，高等植物或动物的无菌培养（无菌饲养）也可说是一种纯培养。纯培养最重要的是在于微生物的生理研究，方法是依靠灭菌和分离，是由巴斯德（L．Pasteur）和柯赫（R．Koch）建立起来的。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物；也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。第二十一页，共七十五页，2022年，8月28日纯培养pureculture，axenicculture微生物学纯培养(pureculture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.克隆与菌落纯：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture，克隆）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。而一般通过简单划线而得的仅称菌落纯。得到纯培养的过程称为分离纯化。第二十二页，共七十五页，2022年，8月28日微生物学实验最基础的工作

平板和单菌落分离技术微生物中最常的是一种带盖的平皿，称为培养皿。平板：皿中装入以琼脂为凝固剂的液态培养基，冷却后凝固形成一个平面，用于微生物的分离和培养称为平板。菌落：各个彼此分开微生物个体在固体平面上，每个分开的微生物个体在胶冻状的固体培养基中生长时，将繁殖出同类微生物的肉眼可见群落，称为菌落。第二十三页，共七十五页，2022年，8月28日培养基的种类与分类第二十四页，共七十五页，2022年，8月28日TypesOfMedia

培养基按物理性状分类Physicalform按化学性状分类Chemicalcomposition按功能进行分类Functionaltype第二十五页，共七十五页，2022年，8月28日按物理性状分类液体培养基半固体培养基固体培养基活体培养基第二十六页，共七十五页，2022年，8月28日液体培养基Liquidmedia（液体培养基）tendtoflowfreelywhenthecontaineristilted一种用于鉴别的液体培养基……Aselectivemediumforidentifyingthisspecies(肠道菌鉴别).ontheleft(o)isaclear,uninoculatedbroth,thebrothinthecenterisgrowingwithoutacolorchange(-),andontherightisabrothwithgrownandcolorchange(+)注释与说明：液体培养基是生物发酵的基本方式。图b为三种液体培养基，其左为未接种，中右为注意接种后的不同表现。第二十七页，共七十五页，2022年，8月28日第二十八页，共七十五页，2022年，8月28日(2)半固体培养基

SemisolidMediaContainasmallamount(0.3%~0.5%)ofAgar.半固体培养基是琼脂含量低(0.3%~0.5%)的一种培养基，其物理性状为柔软的浆糊状。可用于细菌的运动性及生理特性研究（如细菌的微好氧特性研究）。第二十九页，共七十五页，2022年，8月28日SIM培养基(sulfurindolemotilitymedium，硫醚吲哚机动培养基):Possibleresultsstartingfromthefarleftare:nogrowth,nomotility;motility;motilityandproduceofhydrogensulfidegas(硫化氢气体)第三十页，共七十五页，2022年，8月28日(3)SolidMedia

固体培养基固体培养基分可反复液化及不同液体两种类型（Liquefiableandnonliquefiable:Liquefiablesolidmedia,sometimescalledreversiblesolidmedia,containasolidifyingagentthatchangesitsphysicalpropertiesinresponsetotemperature.—）注释与说明：凡呈固体形态的培养基皆可称固体培养基，有直接用天然固体物质的，也有加各种凝固剂（如琼脂）。同时也分可液化及不可液化两类

。第三十一页，共七十五页，2022年，8月28日第三十二页，共七十五页，2022年，8月28日伟大的发现——琼脂,acomplexpolysaccharide(多聚糖)isolatedfromtheredalgagelidium.第三十三页，共七十五页，2022年，8月28日伟大的发现——琼脂,acomplexpolysaccharide(多聚糖)isolatedfromtheredalgagelidium.琼脂做固化剂的优点:(1)适当的凝固点及溶点——solidatroomtemperature,anditmelts(liquefies)attheboilingtemperatureofwater(100℃).Onceliquefied,agardoesnotresolidfyuntilitcoolsto42℃,soitcanbeinoculatedandpouredinliquidformattemperature(45-50℃)thatwillnotharmthemicrobesorthehandler.(注意:混菌法最佳温度是45±1℃）第三十四页，共七十五页，2022年，8月28日(2)很好的可塑造性——Agarisflexibleandmoldable,anditprovidedabasicframeworktoholdmoistureandnutrients,(3)非易降解物——itisnotadigestiblenutrientformostmicroorganisms.一般用量：Anymediumcontaining1%to5%agarusuallyhasthewordagarinitsname——某某琼脂…….第三十五页，共七十五页，2022年，8月28日Animalinoculation:“livingmedia”第三十六页，共七十五页，2022年，8月28日按培养基化学成份

（ChemicalContentofMedia

）Twotypes:合成培养基Synthetic(chemicallydefined)复杂培养基Complexornonsynthetic第三十七页，共七十五页，2022年，8月28日给我一个有效的培养基，让我完成工作（按功能划分培养基）为了获得单一类型的微生物的培养物，微生物学中最常用的技术有两种它们是富集与分离（

(1)富集培养；(2)单菌落分离技术。）这个工作也跟培养基密切相关。第三十八页，共七十五页，2022年，8月28日富集培养基选择培养基鉴别培养基培养基的配方

戏法人人会变，巧妙各有不同第三十九页，共七十五页，2022年，8月28日研究工作的开端：找到它们，并培养出来！富集培养基：Anenrichmediumcontainscomplexorganicsubstancessuchasblood,serum,hemoglobin,orspecialgrowthfactor(specificvitamins,aminoacids.

)thatcertainspeciesmusthaveinordertogrow.注释与说明（1）growthfactor：生长因子，如特别的维生素、氨基酸。（2

)fastidious指难养菌.（3）hemoglobin（血红蛋白）（4）pathogens病原体（5）红色字体分别为链球菌、奈氏球菌（致淋病）（6）agar琼脂，bloodagar血琼脂。第四十页，共七十五页，2022年，8月28日研究工作的开端：找到它们，并培养出来！

——富集培养基Bacteriathatrequiregrowthfactorsandcomplexnutrientsaretermedfastidious.Bloodagar,iswidelyusedtogrowfastidiousstreptococci

andotherpathogens.PathogenicNeisseria(onespeciescausesgonorrhea奈氏球菌，致淋病)aregrownonThayer-martinmediumorchocolateagar,whichismadebyheatingbloodagar.注释与说明（1）growthfactor：生长因子，如特别的维生素、氨基酸。（2

)fastidious指难养菌.（3）hemoglobin（血红蛋白）（4）pathogens病原体（5）红色字体分别为链球菌、奈氏球菌（致淋病）（6）agar琼脂，bloodagar血琼脂。第四十一页，共七十五页，2022年，8月28日血琼脂：Bloodagarplategrowingbacteriafromthehumanthroat.巧克力琼脂Chocolateagar:commonlyusedtoculturethefastidiousgonococcus(getsitbrowncolorfromtheheatedblood,notfromchocolate.)第四十二页，共七十五页，2022年，8月28日富集培养的基本做法富集培养基本是一种选择性培养基。这一培养的要点，就是“投其所好”。如：（1）在没有铵盐的含糖培养基中可能得到某些固氮菌。（但请注意，随着固氮菌的生长，其它细菌也可能随着生长，从而使细菌群体变得十分混杂）用没有糖类但含有硫的培养基我们可能得到硫细菌，而用硫酸铁代替糖，则可能得到铁细菌。第四十三页，共七十五页，2022年，8月28日富集培养的基本做法（2）弱酸性含糖高的培养基，利于酵母和霉菌的生长。（3）隔绝空气（如将液体培养基装满并塞紧，或者如泡菜坛的做法，但应该注意，如果含糖高时，会出现蹦瓶！）（4）加热处理土壤后，再培养，可能得到产芽孢的细菌，而将培养物置于高温下，则可以选择培养嗜热菌。第四十四页，共七十五页，2022年，8月28日富集培养的可能性是无限的……，实际上，富集培养的可能性几乎是无限的，如我们完全可以设计出-利用酒精？橡胶？塑料？或是耐高盐？当然，医学微生物学家们通常很少做这个工作，因为富集过程已经完毕……why?。但是，自然界的一些微生物，许多情况下，对我们的简单富集技术无动于衷，这是微生物学家们最为苦恼的事之一。藐视！第四十五页，共七十五页，2022年，8月28日纯化一但得到富集的群体，即得到了微生物的培养物，微生物学的研究就有了基础。如何使群体纯化，则是下一个首要的问题简单和常用的方法-平皿培养法：把一滴培养物涂布于一个平板上，使各个微生物彼此分开，每个分离的微生物在平板的胶冻表面（或内部）生长，将繁殖出“菌落”，而这些彼此相隔离的菌落可能就是一个纯化的微生物培养物（菌落纯）。第四十六页，共七十五页，2022年，8月28日Thesamemixedsamplecontainingfivedifferentspeciesisstreakedontotheplatesofgeneral-purposeednonselectivemediumandselectievmedium.第四十七页，共七十五页，2022年，8月28日鉴别培养基鉴别培养基（differentialmedium）用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊的化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。第四十八页，共七十五页，2022年，8月28日Nondifferentialanddifferentialmedium第四十九页，共七十五页，2022年，8月28日Contains7.5%sodiumchloride;Adyepinpoint(精确,指明)thosespeciesofStaphylococcous,turnredtoabrightyellow.Whereasmanyotherspeciesareinhibitedbythishighconcentration第五十页，共七十五页，2022年，8月28日MacConkeyagardifferentiatesbetweenlactose-fermentingbacteria(pink-red)andlactose-negativebacteria(nodyereaction)第五十一页，共七十五页，2022年，8月28日第五十二页，共七十五页，2022年，8月28日微生物实验室中5个最基础的工作接种培养分离观察、检查鉴定第五十三页，共七十五页，2022年，8月28日预备工作——样品采集

Specimen(待试物，样品)Collection取样（Specimencollection）:nearlyanyobjectormaterialcanserveasasourceofmicrobes.Commononesarebodyfluids(体液)andtissues,food,water,orsoil.Specimenareremovedbysomeformofsampling(v.取样)device.Thismaybeaswab(涂棒),syringe(注射器),orspecialtransportsystemthatholds,maintains,andpreservesthemicrobesinthesample.第五十四页，共七十五页，2022年，8月28日接种与培养——

ProducingACultureTocultivate,orculture,microorganisms,oneintroduceatinysample(theinoculums接种物)intoacontainerofnutrientmedium(培养基,pl.media),whichprovidesthemicrobeswiththeappreciatenutrientstosustaingrowth;Somemicrobesmayrequirealiveorganism(animal,egg)astheinoculationmedium.第五十五页，共七十五页，2022年，8月28日第五十六页，共七十五页，2022年，8月28日2.1.2分离:从群体中分离出单个种类

SeparatedOneSpeciesFromAnotherTheendresultofinoculationandincubationisisolationofthemicrobesinmacroscopicform.Certainisolationtechniquesarebasedontheconceptthatifanindividualcellisseparatedfromothercellsandprovidedadequatespaceonanutrientsurface,itwillgrowintodiscretemoundsofcellscalledacolony（菌落）.第五十七页，共七十五页，2022年，8月28日第五十八页，共七十五页，2022年，8月28日第五十九页，共七十五页，2022年，8月28日第六十页，共七十五页，2022年，8月28日第六十一页，共七十五页，2022年，8月28日第六十二页，共七十五页，2022年，8月28日倾倒平板技术稀释涂布平板法，可以用于样品计数，其稀释程度以最终每个平板上长出的菌落数约在30-300间为准。第六十三页，共七十五页，2022年，8月28日

观察第六十四页，共七十五页，2022年，8月28日ThreetubescontainingpureculturesofE.coli(white),micrococcousluteus(yellow),andSerratiamactescens(red)AmixtureofM.luteusandE.colireadilydiffe