研究生组织化学概论

病理学技术-组织化学病理学教研室王弦2020/12/181组织切片法

不同的切片制备方法，其切片方法也有较大的差别，组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀仪器等。2020/12/182石蜡切片法

石蜡切片机——LeciaRM2235旋转式切片机2020/12/1832020/12/184轮转切片机具体使用及技巧

1.切片机结构简介：

2020/12/1852020/12/1862.安全性能

操作切片机对操作者而言具有潜在的危险性，在更换刀具和样品的时候，手很容易被割伤，因此在整个操作过程中，安全性是非常有必要再三强调的。

2020/12/187手轮锁2020/12/188

一般切片机都会有手轮安全锁（3），可以将手轮锁定在任意位置。防止手轮意外被触及而带动样品头升降。

而有第二手轮锁（5）的切片机不仅更能确保安全性，还提高了使用的便利性。第二手轮锁职能将手轮把手锁定于最高点，即样品头锁定于距离刀/刀片最远的位置，留出足够空间更换刀具和样品。操作者在切片过程中，单手就可以将手轮锁定/解锁。2020/12/189刀架保护装置

无论是钢刀刀架还是一次性刀片架，刀架上必须配备结合牢固的护刀器（7）（9），在更换样品或者暂时不进行切片的时候，护刀器必须盖在刀架上。好的护刀器必须跟随刀架一同侧向移动，有效覆盖刀锋的全长。

2020/12/18102020/12/18113.切片机功能简介：回缩功能

回缩功能开启，切片行程中当样本头上升到最高点时，样品头向刀架反方向回退200μm，防止刀刃和样品的互相接触或摩擦。

2020/12/18122020/12/1813样品头定位装置：

带有0位指示器（32）的样品头定位装置能以最便捷的方式矫正蜡块/样品的平面，直到和刀刃平行。锁杆（29）用来紧固/放松样品头定位器，旋转旋纽（30）可以使定位器作南北向旋转，旋转旋纽（31）可以是定位器作东西向旋转。每个方向最多旋转8°，旋纽上标有刻度，每旋转一圈可控制样品头旋转2°。

2020/12/18142020/12/1815刀架（一次性刀片架）

（9）护刀器，切片时翻下，更换样品或结束切片时，一定要翻上，覆盖住刀刃。

（10）压板控制锁杆，紧固/放松刀片

（11）刀架侧向移动控制锁杆

2020/12/1816刀架需要定期拆开进行清洁以确保切片良好工作状态。以下是清洁步骤：

1.翻下护刀器(9)。

2.向前旋转侧向移动锁杆（11），并向外拉出锁杆。

3.连同压板（83）一起，推动刀架底盘（86），直到底盘和压板一起从刀架弧形基座（87）上取下。

4.向下旋转压板控制锁杆（10），并将锁杆向外拉出。

5.取下压板（83）。

6.擦拭刀架的所有部件。（请不要使用二甲苯或含有酒精的清洗液，比如玻璃清洁液。）

7.擦干所有部件并重新安装回原样。

8.清洁所有活动部件后，在部件上涂上薄层的机油。

9.在安装压板（83）时，必须保证压板上缘和刀架底座的后缘平行且在同一水平。

2020/12/18172020/12/1818调节刀架的间隙角

(1)刀架的刻度0、5、10是用来提示刀的间隙角。位于刀架的右侧。

(2)在刀架底座上也有相应的刻度，在调节间隙角时候可以参考。

(3)用专用六角扳手拧松螺丝，刀架就可以移动。

(4)移动刀架，直到刀架底座上刻度线对准刀架上指定的读数。放大图示中显示的间隙角读数为5。

(5)保持刀架的位置，然后重新用扳手紧固螺丝。

2020/12/18192020/12/1820样品夹

常见样品夹一般分夹蜡块的标准样品夹和夹包埋盒的通用样品夹。

2020/12/1821

标准样品夹特殊样品夹如果需要夹圆柱形或球形样品，可以在标准样品夹的基础上配合使用V型插件，可确保样品固定恰当。

2020/12/1822

组织经石蜡包埋制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。现在病理诊断最常用的制作切片的方法。在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（修块），但也不能留的太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切4－6um的切片，特殊情况可切1－2um。2020/12/1823

要观察病变的连续性可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织便于长期保存，因此石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。2020/12/1824一、切片前的准备1.固定后的标本经脱水透明浸蜡和包埋以后，制成蜡块。2.石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介作用。应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，组织四周留2mm的石蜡边。3.检查切片刀是否锋利。2020/12/18254.待切蜡块用冰块冷却，或置于冰箱中冷却，以增强其硬度。5.将切片漂烘仪调至48℃，对水中的气泡，矿物质杂质和残留的组织碎屑应及时的除去。6.准备载玻片，毛笔，镊子，铅笔。2020/12/1826二、常规的制片室应准备以下用品清洁的载玻片恒温烤片机大、中号优质狼毫毛笔眼科弯镊子，铅笔展片盆、染色架2020/12/1827三、切片的制作过程⑴将预先冷却的组织装在切片机固定器上。

⑵切片组织经过粗切，待组织充分切完整，右手旋动切片机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻摄蜡片，以正面放入展片盆中，待摊平整后捞片。

⑶捞片在载玻片上的二分之一以处。

⑷切片附贴后，放在空气中稍凉干，即可进行烤片。

2020/12/1828四、切片的注意事项⑴凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制好切片。

⑵固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅、轮廓不清，出现不等的片状发白区。

⑶组织脱水，透明和浸蜡过度，会造成过硬、变脆，特别是动物组织应严格控制。

2020/12/1829⑷切片出现横皱纹常多见于组织固定不牢，或切片刀固定不紧。

⑸切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，更不能顺利地将切片联结成蜡带。切片刀如有缺口存在，更易造成切片断裂、破碎、不完整等现象。

⑹组织切片机各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动，以致切片厚薄不均。2020/12/1830⑺静电的消除在冬天，静电是很常见的，如果增加环境的湿度，静电很容易被消除（在室内烧水）。用干燥纸摩擦工作区域也会有所帮助。2020/12/1831冰冻切片法冰冻切片机——LeciaCM1900双压缩机式冰冻切片机

2020/12/18322020/12/18332020/12/1834

冰冻切片在组织学技术中应用范围较广，对病理学中的临床手术的快速诊断其意义更大。冰冻切片不经过各级乙醇的脱水及二甲苯的透明等过程，因此对于脂肪和类脂的保存较好，在进行脂肪染色和神经组织髓鞘的染色时常用。冰冻切片利于一些抗原的检测，比如做免疫荧光检测，需要利用冰冻切片，因石蜡切片会使抗原产生交联。2020/12/1835一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、低温冰箱冷藏的组织块等。组织块可以不经任何的包埋剂或用甲基纤维素（OCT）包埋后，直接放在制冷台上冷却后进行切片。2020/12/18361.二氧化碳冰冻切片法2.甲醇制冷器3.半导体制冷冰冻切片法4.恒冷箱切片

LeciaCM1900｝了解内容2020/12/1837二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般用于冰冻切片易碎的组织，特别是某些有树突状突起的组织，当切片入水以后常引起分散，甚至产生丢失，某些间歇较多的组织，也可因结构散乱而失去固有的联系，形成移位。明胶冰冻切片可避免以上情况的发生。2020/12/1838步骤：参考教科书P212020/12/1839三、冰冻切片粘片法1.蛋白甘油粘片法2.Lillie明胶粘片法3.酒精明胶粘片法2020/12/1840四、冰冻切片注意事项1.所有试剂和机器都要处于可供使用的状态2.切去的组织块大小适宜，厚度小于2mm，并尽快置于冰冻切片机上制备切片3.调节冰冻程度，试切合适时便迅速切片，冰冻不足无法切片，冰冻过度切片易碎2020/12/18414.固定：切片后应立即投入甲醇中固定，否则会造成细胞的退变，固定液有很多种（乙醚＋酒精，酒精＋冰醋酸，甲醇，乙醇，丙酮），但是经过实践认为，甲醇作用快，受缩小，染色较清晰，是最理想的固定剂，如加5%冰醋酸，效果更好。5.包埋剂：可用普通胶水代替，最好加入适量的水（胶水：水＝2：1）2020/12/18426.做冰冻切片应带手套，防止感染，注意不要切到手！7.切片一般在5um.8.切片要完整，不要有皱褶，染色要清晰，防止有冰晶（托盘要放入机箱待用，OCT尽量少一些，要用冷锤）2020/12/1843

补充要点：关于切片质量

1、冰晶多：这是最普遍的现象，主要原因是冷冻速度慢：（1）将标本托盘放在外面，这是错误的，热的托盘会延长冷冻的时间，增加冰晶的产生。（2）胶放得太多，同样也会延长冷冻的时间。

冰晶会使诊断产生误诊，特别是软组织肿瘤和含水量较高的组织。2020/12/18442、细胞退变：切片粘在玻片上要立即固定，固定时间越快，细胞退变越少，从固定速度上看，甲醇是最快也是最好的。3、细胞收缩：

用电吹风吹或用丙酮固定，都会引起细胞收缩，但如果没有对照，不是很明显。

2020/12/18454、染色较浅：

主要是苏木素的染色时间应该用显微镜观察一下5、切片有很多空洞：

主要是肝脏，由于动物冷冻后发脆，粗切时肝组织呈大块大块的粉状，肝切片上有很多的小白点（即肝组织掉出），这就要求我们多细切几下。2020/12/18466、皱折：

主要是选择展片的方法不一样造成：有的用毛笔慢慢拉下在切片台上，然后用玻片粘；有的用毛笔在组织块成小卷后拉开，然后用玻片粘；这二种情况在组织好切，心情平各时，也能做出好片子。但在比赛时，肾上腺素较高，手多多少少会颤抖，容易造成拉力不均匀，导致切片出现小皱。还有组织边上留胶太少，会造成组织边缘出现皱折。

2020/12/18477、组织发脆：冰冻切片机冷冻室的温度冬天一般设在－19℃，夏天设在－22℃

不同的组织，对温度要求不一样，肝脏和甲状腺－15℃，脂肪组织－35℃

如果遇到组织有很多的裂痕，说明温度过低，可用手指稍微去摸一下

2020/12/1848冰脆：2020/12/1849核退变：2020/12/1850冰晶多冰晶少2020/12/1851大组织石蜡切片法

制备大组织块可观察完整的组织病变情况，以及保持结构上的连续性。有时在病理诊断上有重要的意义。因为有些病变在肉眼上无法分辨正常组织和病变组织的界限，尤其像甲状腺组织肿瘤，观察有无胞膜浸润或胞膜是否完整，如不用大块组织，则必须将一完整肿瘤的断面分成若干小组织块，如果包埋不当或者切面不正，则无法全面观察病变组织的分布情况2020/12/1852而影响诊断。因此制备大组织石蜡切片很有必要。2020/12/1853制备方法：1.固定后取材2.冲洗3.脱水，透明，浸蜡表格参考P174.包埋5.切片：大块组织切片较难，可采用以下方法较少阻力2020/12/1854（1）包埋可采用52－54℃的石蜡，以减少一些硬度。（2）切片前蜡块不需要冰箱内冷却，防止过硬（3）切片刀要锋利，组织蜡块稍倾斜，以较少阻力。6.展片和烘片7.染色8.观察2020/12/1855其它切片法1.塑料切片法塑料包埋组织的切片方法与常规切片方法相同。可同时进行光镜和电镜的检测，定位准确。塑料包埋切片的厚度可达0.5－2um（半薄切片）。塑料切片主要用于免疫电镜的超薄切片前定位。包埋前染色的标本，切半薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察。免疫反应部位成黑点状，定位后进一步做超薄切片，这样可明显提高免疫电镜阳性检出率。2020/12/18562.碳蜡（PEG）切片按石蜡切片法切片，但在操作中注意碳蜡块尽量不要接触水和冰块，储存应密封干燥冷藏该方法的缺点是夏季室温高时，切片困难，连续切片不如石蜡切片容易，碳蜡吸水性较强，也不易长期保存。2020/12/18573.超薄切片用于电镜标本的制备4.石蜡包埋半薄切片法同常规方法，但切片刀要锋利，最好用一次性刀片，气温高时，可将蜡块和切片刀冷却后切片。2020/12/1858HE染色

苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。2020/12/1859试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：苏木精2g无水乙醇250ml硫酸铝钾17.6g蒸馏水750ml碘酸钠0.2g冰醋酸20ml

2020/12/1860配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水.两溶液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。2020/12/1861分化：用某些试剂，将过度染色或者不需要着色的组织成分上的颜色除去。蓝化：用明矾苏木素液深染细胞核后，通过盐酸乙醇的分化，切片从酸性环境中（此时，切片呈红褐色）转移至流水中使之变蓝的过程。明矾苏木素液这种红变蓝的现象，本质上是染料苏木红加铝（蓝色色精）之间的结合或者中断关系。一般来讲，在酸性环境中，使深蓝色的色精处于离子状态，此时为红色，这种现象称色精形成中断。相反，红色离子状态的色精，在碱性环境中（相对地说）处于结合状态，这种现象称色精形成，并呈蓝色。2020/12/1862染色流程

(1)二甲苯（Ⅰ）10min

(2)二甲苯（Ⅱ）10min

(3)100%乙醇（Ⅰ）1min

(4)100%乙醇（Ⅱ）1min

(5)80%乙醇2min

(6)蒸馏水1-2min

(7)苏木精液染色5min

(8)流水稍洗去苏木精液1-3s

(9)1%盐酸乙醇1-3s

2020/12/1863

(11)流水冲洗10min

(12)0.5%伊红液染色1-3min

(13)蒸馏水稍洗1-2s

(14)80%乙醇稍洗1min

(15)95%乙醇（Ⅰ）1min

(16)95%乙醇（Ⅱ）1min

(17)无水乙醇1min

(18)无水乙醇1min

(19)二甲苯（Ⅰ）1min

(20)二甲苯（Ⅱ）1min

(21)二甲苯（Ⅲ）1min

(22)中性树胶封固

2020/12/1864冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）3min（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇10s（12）95%乙醇10s（13）无水乙醇10s（14）无水乙醇10s（15）二甲苯（Ⅰ）10s（16）二甲苯（Ⅱ）10s（17）中性树胶封固。2020/12/1865染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色2020/12/1866注意事项：1.脱蜡2.烤片温度和时间3.染色时间，根据试剂新鲜程度4.盐酸乙醇分化必须控制时间，分化可以选择温水5.脱水必须充分6.透明必须充分，封片尽量湿封2020/12/1867常用的特殊染色一、特殊染色的意义1.显示HE染色切片中看不到的目的物2.区别HE染色切片中一些难以鉴别的病变3.使HE染色切片中不明显或容易被忽略的目的物变得明显易见2020/12/1868二、特殊染色的分类结缔组织、肌肉组织、神经组织、脂类物质、糖类、色素类、病理的内源性沉着物、病原微生物、内分泌、单种细胞、性染色质、骨、血液、造血组织、核酸、酶类等2020/12/1869三、特殊染色的命名1、按发明者的姓名命名2、按所用染色剂命名3、按显示的目的物命名4、采用混合性命名2020/12/1870四、学习特染技术应掌握的重点

（注意事项）

（1）染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等方面找原因。

（2）注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特染方法，一种或多种。2020/12/1871

（3）必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。

（4）尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE切片作对照。

（5）特染的组织，在其固定、脱水根据要求选择。所用的器皿都必须化学清洗。

2020/12/1872三、玻璃器皿的清洁

在病理实验室可用的玻璃器皿，都必须经过清洗干净才能使用，清洗的方法依玻璃器皿的新旧而不同。2020/12/18731、新购玻璃器皿的处理

对于新购买的玻璃器皿应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用1—2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用少量蒸馏水洗2次。

2020/12/18742、使用后玻璃器皿的处理

每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用硫酸清洗液浸泡。2020/12/1875硫酸清洗液配制

重铬酸钾80g

自来水1000ml

浓硫酸（工业用）120m

新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。2020/12/18763、玻璃器皿的清洗方法

①任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液洗去。

②用毛刷沾洗衣粉擦干净。

③自来水冲洗，蒸馏水洗2次。

④把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。

⑤取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次。

⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存放橱内备用。2020/12/1877糖类

单糖糖类双糖淀粉植物界多糖→纤维素糖原→动物组织（动物淀粉）中性粘多糖粘多糖酸性粘多糖2020/12/1878一、糖原㈠糖原的分布㈡糖原染色的应用1、诊断糖原累积病2、糖尿病的诊断及研究3、证明与鉴别细胞内空泡状变性4、用于某些肿瘤的诊断与鉴别2020/12/1879㈢糖原染色的种类1、过碘酸—Schiff反应（PAS）2、碘染色3、胭脂红染色法㈣糖原染色原理㈤糖原染色法、过碘酸—Schiff反应（PAS）2020/12/1880二、粘多糖㈠分类与分布1、分类：中性粘多糖氨基已糖游离已糖基

酸性粘多糖氨基已糖各种酸根2020/12/1881分布:中性粘多糖胃粘膜表面上皮十二指肠肠腺等酸性粘多糖呼吸道的杯状细胞

消化道的杯状细胞

2020/12/1882（二）粘液物质染色的应用1、证实及鉴别胃粘膜的肠上皮化生2、研究胃癌的组织发生3、粘液病和粘液肉瘤4、软骨粘液样纤维瘤、粘液胚胎性横纹肌肉瘤5、鉴别粘液表皮样癌与鳞状细胞癌6、鉴别粘液腺癌与未分化鳞癌2020/12/1883（三）粘液物质染色方法阿利新兰过碘酸雪夫氏反应（AB/PAS）

(四)粘液物质染色原理（五）粘液物质染色2020/12/1884脂类染色一、脂类的定义脂类是油脂、类脂以及它们的衍生物的总称。脂类物质简称脂质。二、脂类的性质

1.化学性质脂类中最多是真正的脂肪（油），是脂肪酸和甘油形成的。在性质上它通常是三个脂肪酸分子（饱和或不饱和的）与一个甘油分子相结合形成的甘油三酯。绝大多数自然存在的甘油三酯是混合的甘油三酯，就是说它们是含有两个或三个不相同的脂肪酸。还有少部分的简单甘油三酯，它们是含有同一种脂肪酸的甘油三酯。2020/12/18852.物理性质脂类的比重小于1，所以比水轻，根据室温及其熔点呈固态或液态。熔点取决于两个因素：一是脂肪酸的链长（增加而升高）；另外就是脂类的饱和程度（增加而升高）。3.存在形式（1）.储存脂质：大量存在于脂肪细胞中，广泛分布于皮下、大网膜、肠系膜、肾和胰等脏器周围以及肌间组织等处。储存脂质具有支持、保护、维持体温等作用，并参与能量代谢，故又称为能量库。（2）.基本脂质：存在于细胞内，是细胞原生质的组成部分或形成某种特殊的结构，如细胞膜、线粒体、髓鞘。脂质往往和组织的蛋白质结合而形成脂蛋白。2020/12/1886三、脂类的类型脂类分为油脂、类脂及其衍生物。油脂（单纯脂）就是油和脂肪的统称。1.中性脂肪（脂肪）：又称甘油三酯，是甘油和脂肪酸所形成的脂。脂肪又分为简单甘油三酯和混合甘油三酯。2.类脂（复合脂）：磷脂、糖脂、胆固醇及其酯。3.衍生脂类：上述脂类的水解产物，包括脂肪酸及其衍生物、甘油、鞘氨醇等。2020/12/1887苏丹III染色法一、原理苏丹染料对脂肪染色的机制一般认为是物理学上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染色，即先把苏丹染料溶于有机溶剂中，这种染料在冰冻切片内脂质的溶解度较在原有溶剂中的溶解度更大，所以在染色时染料就从有机溶剂中转移入脂质中而使脂肪显示颜色。二、固定

10%甲醛溶液三、试剂配制苏丹III染液：苏丹0.15g，60%~70%乙醇100ml。将苏丹60%~70%乙醇或60%~70%乙醇与丙酮的等量饱和混合液，此溶液配制完毕后应充分溶解，形成饱和沉淀液作为备用液。若临时配制需过滤后才能使用。注意事项：

1、使用备用液时不能摇动试剂瓶，应缓慢倾倒。

2、盛放此溶液的容器需塞紧盖严，防止挥发导致染色时沉淀。2020/12/1888四、染色步骤1.冰冻切片厚8--18um2.蒸馏水稍洗3.Harris苏木素液中染约1min4.自来水洗后，用0.5%盐酸乙醇分化，再水洗直至细胞核返蓝为止5.蒸馏水洗后移入70%乙醇内浸洗一下6.浸入苏丹III染液中约30min或更长时间。若置于56℃温箱中可适当缩短时间7.在70%乙醇中分化数秒钟8.将切片浸于蒸馏水里，待组织片上的乙醇洗净，然后用玻璃棒挑捞切片贴在载玻片上9.待切片在空气中稍晾干或用冷风机吹稍干10.及时用甘油明胶封片五、染色结果脂肪呈红色，胞核呈蓝色2020/12/1889油红O染色法一、原理利用染料易溶于脂质的性质证明组织脂质含量的多少二、固定10%甲醛、甲醛—钙固定液三、试剂配制油红O染色原液：油红O0.5g,异丙醇（含量98%以上）100mL充分溶解后作为储存液（染色原液）。临用时取染色原液6mL加蒸馏水4mL，稀释，静置5-10min后过滤，次液保存不得超过1-2h2020/12/1890四、染色步骤1.冰冻切片厚8--18um，后进行水洗2.置于密封容器盛装的脂肪染色剂内（稀释后的油红染液）10-15min3.用60%的乙醇分色4.水洗5.在Harris或其他苏木素淡染30s6.用水或者1%的磷酸氢二钠冲洗至变蓝7.附贴与载玻片上，稍干8.用甘油明胶封固五、染色结果脂肪呈红色，胞核呈蓝色2020/12/18912020/12/1892网状纤维染色1、定义网状纤维（reticularfiber）是一种纤细的纤维。它穿行于网状细胞体和突起分支，并互相交织成网，因而被称为网状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显著。故又称为嗜银纤维。2020/12/18932、形成它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内浆网中，合成可溶性胶原。在醛糖、类脂的作用下，形成可溶性胶原，随后它被分泌到细胞外，在基质中（或在细胞的表面）通过原胶原蛋白分子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维。2020/12/18943、特点网状纤维纤细，直径0.2-1μm,没有弹性，而有韧性，能抵抗胃液的消化和弱酸的腐蚀。它的主要成分也是胶原蛋白，在电镜下也有胶原原纤维特有的周期性横带。因此，网状纤维在分子结构上可能和胶原纤维相似，只不过胶原原纤维补蛋白质和多糖的基质粘聚成束，形成胶原纤维后，从而失去嗜银性。所以胶原纤维银染色呈阴性而网状纤维则呈阳性，网状纤维的原纤维上包有一层糖蛋白，据称这是导致它有嗜银性的原因。

2020/12/18954、分布网状纤维的分布很广泛，常以两种形式存在。一种是以网状结缔组织形式分布，即有网状纤维和网状细胞同时存在。多分布于造血器官和淋巴网状器官,如红骨髓、脾、淋巴结、肝、扁桃体和胸腺,消化管和呼吸道管壁的淋巴组织内,并成为这些器官的网状支架。另一种是以网状纤维单独存在,没有网状细胞伴随,见于上皮的基底膜,还有平滑肌,脂肪细胞,毛细血管和神经纤维都有网状纤维包裹。我们日常所称的网状纤维染色,主要是显示淋巴网状组织的网状纤维,因为这些组织网状纤维的增多或减少,崩解成断裂,都有助于病理组织上的诊断。

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显示网状纤维主要是用银浸染法。银浸染技术最初是由Bielschowsky氏于1904年设计用于神经原纤维的研究,后经Maresch氏于1905年发展应用于网状纤维染色。以后,网状纤维染色技术就在此基础上逐步发展为各种银氨液浸染法。例如Perdrau氏法,Foot氏法,Gomori氏法,Wilder氏法,Gorden-Sweets氏法,James氏法,Naounenko-Feigin氏法等十多种。2020/12/1898

在这些方法中,他们主要不同点,一是所使用的氧化剂不同,如有些用高锰酸钾氧化,有些用高锰酸钾和硫酸氧化,有些用高碘酸氧化。目的是要增强氧化的效果,使网状纤维的染色加强,背景更为清晰。二是所使用的银氨液不同,如硝酸银氨液,碳酸银氨液,醋酸银氨液以及氢氧化银氨液等。这些都是配位化合物,简称配合物(旧称络合物)。它们都有一共性,即是每种银氨液都处于离子状态,即离解成带有正电荷的Ag(NH3)2+和带有负电荷的N03-、CO3-、CH3C00-、0H-等。

一般来说,氧氧化银氨液(又称氢氧化二氨合银液)是银氨液中最易被还原,容易和组织结合的一种,故一般多采用。但该液较不稳定,对光的敏感性强,故配制后容易形成沉淀，不易保存。2020/12/1899原理：组织经过氧化剂的氧化使网状纤维对银离子具有选择性的亲和力，并在媒染剂的作用下，氨银液被组织吸咐与组织中的蛋白结合，经甲醛还原成黑色的金属银沉积于组织内及表面。用氯化金调色后，再用硫代硫酸钠液洗去未还原的银盐，从而将组织内的网状纤维清晰地显示出来。2020/12/18100染色的应用：（一）、用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源1）显示和区分癌和肉瘤癌巢周围存在网状纤维，肉瘤网状纤维包绕每个细胞2020/12/181012)显示和区分血管内皮瘤与血管外皮瘤血管内皮瘤的瘤细胞在网状纤维膜内，而血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤的瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤的瘤细胞可见较多的网状纤维。3）用以鉴别淋巴细胞肉瘤与网状细胞肉瘤前者瘤细胞间的网状纤维比正常稍减少，后者则比正常时增多。2020/12/181024）区分骨尤文氏肉瘤与骨网状细胞肉瘤5）显示与鉴别骨异常增生与骨化性纤维瘤6）区分软骨粘液纤维瘤与粘液肉瘤7）鉴别脑膜瘤与星行细胞瘤脑膜瘤有网状纤维2020/12/18103（二）用于某些肿瘤的诊断1）平滑肌肉瘤瘤细胞间可见大量平行分布的网状纤维2）纤维肉瘤大量网状纤维密集包绕细胞3）滑膜肉瘤其梭形细胞产生网状纤维少4）恶性神经鞘瘤网状纤维与梭形细胞平行排列，不包绕细胞两端注：大多被免疫组化取代，很少用2020/12/18104（三）用于观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度（四）显示与观察基底膜的变化如：原位癌，可见有完整的基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏的基底膜。（五）用于识别坏死组织的结构及类型1）凝固性坏死2）肺结核干