免疫共沉淀原理及实验方法

注册┆登录┆发表文章免疫共沉淀原理及试验方法2023-03-2216:07:46大中小IPproreinA“特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proreinAargarose的beads体反响后，beadsproreinA试验最需要留意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合力量也不同，免染能结合未必能用在IP反响。建议认真检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要留意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必需要使其溶解。为此，必需使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一局部抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原打算族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的凄惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必需加蛋白每抑制剂，低温下进展试验。每次试验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#vortex#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig#PBS#NaN3#proteinAsapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液RIPA缓冲液(最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%TritonX-10025ml(1%)10%DOC50ml(1%)10%SDS5ml(o.1%)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW395mltoal500ml另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。留意不易溶于水)NP40lysis缓冲液1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%NP4025ml(1%)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW450mltoal500ml1mMPMSF留意点：*TrisPHPH*PMSF*1和2的缓冲剂的区分在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温存，，DOC<SDS是离子性的强活性剂。留意遗忘加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2*两方都有EDTAMg,CaEDTANaOHProtocol1proteinAsapharoseproteinAsapharose5ml溶于20ml0.02%NaN3PBS2023转20.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复220ml0.02%NaN3PBS，冷藏保存proteinAsapharoseIg50ulproteinAsapharose用1-5ul1-2h1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避开长期保存。抗原的检出以下操作全在冰面或4度进展去除细胞培育液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA6cm的培育皿加1ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。30m，15000rpm离心，上清转移到tube。不用移液枪，直接从tubetube往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1hproteinAsapharose50ul1h5000rpm1s,sapharosesapharoseRIPA，vortex混4加电泳用sample40ul,2m煮沸，泳动后，固定/枯燥胶，现像。留意点A：不娴熟使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使试验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。B：对电泳的非特异条带，最终可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)评论引用阅读(876)圈子打印有奖举报免疫共沉淀原理及试验方法FCproreinAargarosebeadsbeadsproreinA[BR][BR]试验最需要留意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合力量也不同，免染能结合未必能用在IP是问题。[BR][BR]其次，要留意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必需要使其溶解。为此，必需使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一局部抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原打算族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP结果。[BR][BR]再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必需加蛋白每抑制剂，低温下进展试验/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降beads必要。(待续)[BR][BR]器械[BR]#[BR]#[BR]#旋转盘[BR]#[BR]#vortex[BR]#[BR]#eppentube[BR][BR]#[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#proteinG,Ig清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinAsapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液(最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)[BR]5MNacl15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%TritonX-10025ml(1%)[BR]10%DOC50ml(1%)[BR]10%SDS5ml(o.1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW395ml[BR]toal500ml[BR]另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在100mM-20)[BR]2.NP40lysis缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%NP4025ml(1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW450ml[BR]toal500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]留意点：[BR]*TrisPHPH[BR]*PMSF，，DOC＆lt;SDSTritonX-100DOC，SDS，可能使抗体完全失两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,CaEDTA用NaOH滴定。[BR]Protocol[BR][BR]1调制proteinAsapharose[BR][BR]proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3PBS[BR][BR202320.02%NaN3PBS，离心后去上清，重复220ml0.02%NaN3PBS，冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时，把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,1-2s[BR][BRPBS，vortex[BR][BR]0.02%NaN3PBS[BR]4[BR][BR]去除PBSRIPA，eppentubevortexRIPA6cmtubetubetube[BR][BR]往上清加抗体，1ml2-5ul1h[BR][BRproteinAsapharose50ul，再混匀1h[BR][BR]5000rpm1s,sapharosesapharose4不娴熟使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使试验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。[BR]B：对电泳的非特异条带，最终可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)[/SPAN][BR]查看文章免疫共沉淀技术路线(CoIP)2023-05-0709:14预备工作：PBS，RIPABuffer，细胞刮子〔用保鲜膜包好后，埋冰下〕，离心机PBSPBS；10cm150cm20.5ml/5×1066cm75cm21.5EP4℃，15min〔EP〕4℃，14000g15min，马上将上清转移到一个的离心管中建议减掉枪尖局部，避开在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠管插冰上，置水平摇床上〕，以去除非特异性杂蛋白，降低背景ProteinA珠子1：10〔-20℃保存一个月〕PBS1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，假设〔10μg/μl〕同细胞系中的多少而异2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议2h100μlProteinA，4℃缓慢摇动抗原1h，假设所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl“过渡抗体”〔IgG，IgG〕RIPAbuffer3，800μl/遍，RIPAbufferPBS冲液的量依据上样多少的需要而定〔60μl〕5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以临时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。根底成分：Tris-HCl〔缓冲液成分，防止蛋白变性〕NaCl〔盐份，防止非特异蛋白聚拢〕NP-40〔H2O10%储存液〕去氧胆酸钠〔H2O10%储存液；避光保存〕〔致活酶〕试验时，不要加去氧胆酸钠，由于离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。RIPA苯甲基磺酰氟〔PMSF〕〔200mM〕EDTA〔H2O100mMPH7.4〕H2O1mg/ml保存〕〔Aprotinin〔H2O1mg/ml-20℃保存〕1mg/ml-20℃保存〕RIPA〔酯〕酶抑制剂200mMSodiumOrthovanadateActivationProtoco〕NaF〔200mM〕留意：在预备做磷酸〔酯〕酶试验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：100mlmodifiedRIPAbuffe：75ml900mgNaCl，搅HClPH7.42.10ml10NP-402.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清1ml100mMEDTA，100ml，2-8℃保存理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应当在使用当天同时参加〔抑蛋白酶肽，100µl;PMSF,Na3VO4,NaF500µl〕，但是PMSF在水溶液中很不稳定，30PMSF5各种成分在工作液中的终浓度：Tris-HCl:50mM,pH7.4NP-40:1%去氧胆酸钠：0.25%NaCl:150mMEDTA:1mMPMSF:1mM抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:各1µg/mlNa3VO4:1mMNaF:1mM通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．3010cm1ml冰冷的