大四上学期临检免疫ckam

临床微生物学临床免疫学教研室侯珏第十四章细胞因子与粘附分子的检测及应用

教学目的1.掌握细胞因子和粘附分子免疫学检测法2.熟悉细胞因子和粘附分子的特性3.了解细胞因子生物学检测法以及细胞因子和粘附分子生物学检测法4.了解细胞因子和粘附分子检测的临床意义第一节细胞因子与细胞因子受体细胞因子

是主要由活化的免疫细胞或间质细胞所合成、分泌的具有生物活性小分子多肽或糖蛋白（cytokine,CK

）一、分类

根据细胞因子的来源：1、淋巴因子（lymphokine):淋巴细胞产生

IL-2、3、4、5、6、9、10、11\12、13、TNF-2、单核因子（monokine):单核-吞噬细胞产生

IL-1、

IL-8、TNF-、IFN-根据主要生物学功能：

白细胞介素(interleukin,IL)

肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)

干扰素(interferon,IFN)

集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)

趋化性细胞因子(chemokine)

转化生长因子（transforminggrowthfactor,TGF）

其它细胞因子类

:EGF,NGF,PDGF二、细胞因子的共同特性1、理化特性绝大多数为低分子量（10~25KD）的糖蛋白多数细胞因子以单体形式存在，只有少数细胞因子如IL-5、IL-12、

M-CSF、TGF-ß等以双体形式存在2、作用的高效性通过与其受体结合而发挥效应，量微而作用强在体内pM水平即可显示明显的生物学效应

3、分泌特点自分泌：作用于产生细胞本身旁分泌：作用于产生细胞临近的细胞内分泌：作用于全身远处的靶细胞:IL-1和Multi-CSF作用于分泌细胞自身4、作用的复杂性

同一种细胞因子可由多种细胞产生:

IL-1可由单核/巨噬细胞、B细胞、

NK细胞、内皮细胞、成纤维细胞、表皮细胞产生一种细胞可产生多种细胞因子:

活化的的T-C可产生IL-6、IL-9、IL-10、

IL-13、IFN-r、TGF-ß、GM-CSF等

多效应：一种细胞因子可对多种靶细胞发挥作用产生多种不同的生物学效应重叠性：几种不同的细胞因子可对同一种靶细胞发挥作用，产生相同或相似的生物学作用，如IL-2、IL-4和IL-9都能维持和促进T-C的增殖等拮抗效应:一种细胞因子可以抑制另一种细胞因子的生物学作用协同效应：一种细胞因子可以增强另一种细胞因子的某种生物学作用

*各种细胞因子在体内形成极为复杂的相互影响、相互制约的关系，并以网络的形式发挥作用（网络性）多效性重叠性协同拮抗Cascadeinduction三、细胞因子的受体细胞因子作用的发挥依赖于细胞表面的受体，细胞因子和相应受体结合可以传导细胞信号，使细胞活化、增殖细胞因子受体主要表达于细胞表面，与细胞膜结合形式存在外存在着分泌游离形式（或结合细胞因子受体从膜表面脱落）即可溶性细胞因子受体,可与相应的膜受体竞争配体而起抑制作用细胞因子受体由胞外区、跨膜区、和胞内区三部分构成多数由2个或2个以上的亚单位组成，其中α链为细胞因子特异性结合亚单位，β链为信号传递亚单位。细胞因子受体结构四、细胞因子的主要生物学作用

抗感染和抗肿瘤免疫调节作用

刺激造血功能参与和调节炎症反应上调免疫应答下调免疫应答

第二节细胞粘附分子粘附分子（adhesionmolecules）一、基本概念介导细胞间或细胞与细胞外基质（ECM）间相互接触和结合分子的统称大多是糖蛋白，分布于细胞表面或细胞外基质中以配体-受体结合的形式发挥作用导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞之间的粘附参与细胞间的识别、细胞的活化和信号转导、细胞的增殖与分化、细胞的伸展与移动免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移、创伤愈合二、分类

根据其结构特点分为

整合素家族选择素家族免疫球蛋白超家族黏蛋白样血管地址素钙粘素家族未归类的黏附分子1.整合素家族（integrinfamily）由αβ两条链经非共价键连接组成的异二聚体介导细胞与细胞外基质的粘附，使细胞得以附着而成整体2.选择素家族（selectinfamily）有L、P和E选择素三个成员单链，胞膜外部分通常含有三个结构域

C型凝集素结构域表皮生长因子结构域补体调控蛋白结构域

配体是寡糖基团三、黏附分子的功能1.免疫细胞识别中的辅助受体和提供协同刺激信号ICAM-1B7ICAM-2

VCAM-1CD58

CD8/CD4CTLA-4LFA-1TCRCD2

VLA-4CD28MHC

I/IIAPC/靶CT细胞免疫应答中重要的粘附分子细胞内颗粒含E-选择素IL-8R活化内皮细胞膜型IL-8E-选择素白细胞的活化2.炎症过程中白细胞与血管内皮细胞粘附

sLeX——E-选择素

LFA-1——Mac-1第三节临床常用检测方法细胞因子粘附分子检测的特点样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差细胞因子粘附分子检测的方法免疫学检测方法——抗原性检测（immunoassay）细胞生物学检测方法——生物活性检测（bioassay）分子生物学检测方法——基因表达检测三种方法之间相互联系互为补充但不能完全替代

一、生物学检测法(生物活性检测）用于细胞因子的测定基本原理：依待测细胞因子特定的生物学活性，用相应靶细胞作指示系统，加入待测标本，观察细胞情况，用标准品对照，可测定出细胞因子的活性水平（U/mL）

肿瘤坏死因子肿瘤细胞

IL-2T细胞干扰素病毒

CSF骨髓细胞有助于细胞因子检测的活性作用包括有助于细胞因子检测的活性作用刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用方法促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法细胞毒活性测定法抗病毒活性测定法趋化活性测定法细胞毒活性测定法原理：某些细胞因子对特定的细胞株有细胞毒作用，使培养细胞死亡，待测标本与靶细胞株培养，检测活的或死的细胞数，用标准曲线对照，可测定出细胞因子的活性水平

(2)技术要点细胞细胞因子？

调浓度测活力细胞准备细胞毒反应程度检测活细胞检测死细胞计算活性肿瘤坏死因子检测L929细胞待检样品37℃、5%CO2放线菌D16—20hHanks液洗涤结晶紫37℃1h

脱色液

吸光度标准曲线

TNF含量放线菌D

抑制DNA的合成降低靶细胞对损伤修复

酶标仪生物学活性测定方法学评价优点：敏感性高，能测出血液中pg

可测定细胞因子的生物学活性缺点：1、特异性差

2、操作繁琐

3、易受干扰

二、免疫学检测法（细胞因子细胞粘附分子的测定）细胞因子细胞粘附分子特异性抗体

ELISA,RIA…酶联免疫斑点试验流式细胞分析法免疫组化法细胞内CK/AM(抗原)细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体结合，通过标记技术加以放大和显示从而定性或定量显示细胞因子(或受体)以及细胞粘附分子的水平可溶性CK/AM（一）ELISA方法夹心法（主）优点：特异、简便、可同时测定大量标本，易于标准化及底物处理。缺点：只能测定其量，不能测定活性敏感性偏低

（二）流式细胞分析法基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测

基本原理

单克隆抗体-荧光素待测细胞基本步骤制备待测细胞活化细胞破膜与固定封闭流式细胞仪

流式细胞仪细胞因子含量阳性细胞百分率平均荧光强度染色（抗体-荧光素）流式细胞分析法应用单个细胞水平检测细胞因子或粘附因子区分不同分泌特性的细胞亚群

Th1细胞IFN-γTh2细胞IL-4用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测细胞表面的粘附分子或细胞因子受体的表达情况

直接或间接荧光抗体染色无需作细胞的破膜和固定待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态（三）酶联免疫斑点试验(ELISPOT)

在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。

基本原理酶联免疫斑点试验单细胞水平检测细胞因子分泌情况细胞因子分泌的总量检测活化淋巴细胞的数量变化一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关（四）免疫学测定方法评价

优点：1.特异性高

2.操作简便

3.影响因素相对较少缺点：1.不能测定生物学活性2.测定的结果与抗体来源及亲和力有关3.敏感性较生物活性测定法低4.标本中有可溶性细胞因子受体可影响其结果5.标本中存在的各种细胞因子结合蛋白可干扰结果三、分子生物学测定法杂交法

PCR

测定细胞因子细胞粘附分子的基因，基因表达情况

mRNADNA

小结仅生物学检测法能检测细胞因子生物活性免疫学测定方法测定细胞因子、粘附分子的量分子生物学测定法测定细胞因子、粘附分子的基因，基因表达情况三种方法之间相互联系，互为补充，但不能完全替代三种方法得出结果可不平行第四节

细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子与粘附分子的测定主要应用于：特定疾病的辅助诊断机体免疫状态的评估临床疾病治疗效果的监测和指导用药疾病预防一、临床应用原则

细胞因子和粘附分子的异质性、功能交叉性和多样性、来源的复杂性和组织细胞的非特异性，决定了在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断作出综合考虑检测方法多种多样，各有利弊每类方法测定的是细胞因子的不同方面应用多种方法测定（一）方法的联合应用常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞相应细胞因子的基因和mRNA表达：相应细胞疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以保证结果的特异性（二）标本的适当选取意义：细胞因子、粘附分子作用的复杂性、网络性检测单一的细胞因子、粘附分子不能提供有效的疾病诊断和机体免疫状态信息举例：欲知T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能：IL-1、IL-2、IFN-γ和GM-CSFTh1/Th2细胞平衡状态：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ（三）细胞因子的联合检测二、特定疾病诊断的辅助指标许多疾病过程均可出现细胞因子表达的异常改变，高表达、低表达或是缺陷均可与某些特定疾病密切关联，同时还可反映疾病的进程

活动性结核：PBMC经结核抗原刺激后，IL-4、INF-γ、IL-2

结核性胸膜炎：胸腔积液INF-γ、IL-2、IL-4

溃疡性结肠炎：肠组织培养上清液IL-15活性明显增加器官移植后：发生慢性排斥反应时IL-6水平明显增高（一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义（二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义

粘附分子有可溶性和膜结合性两种形式，均与机体的免疫状态和疾病的发生有关，在炎症、肿瘤转移和器官移植排斥反应中发挥着重要的作用。相关粘附分子的检测有助于此类疾病的诊断如：E-钙粘素：可在化生的胃粘膜和肠型胃腺癌中异位表达，在腺癌分化较差的区域，表达减少，在未