生物基因工程的基本操作程序课件新人教选修

生物基因工程的基本操作程序课件新人教选修第一页，共六十七页，2022年，8月28日原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)第二页，共六十七页，2022年，8月28日①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子第三页，共六十七页，2022年，8月28日编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构第四页，共六十七页，2022年，8月28日真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点等。非编码序列：包括非编码区和内含子第五页，共六十七页，2022年，8月28日原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第六页，共六十七页，2022年，8月28日餐前小菜味道如何？思考：启动子与起始密码子，终止子与终止密码子是否相同，如不同有何区别？启动子、终止子：在

上，分别表示

的开始与结束起始密码子、终止密码子：在

上，分别表示

的开始与结束转录翻译DNARNA第七页，共六十七页，2022年，8月28日1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。第八页，共六十七页，2022年，8月28日一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成第九页，共六十七页，2022年，8月28日一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：见课本P9第十页，共六十七页，2022年，8月28日(1)从基因文库中获取目的基因1、什么是基因文库？2、什么是基因组文库？3、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本第9页的相关内容，回答以下问题自主学习第十一页，共六十七页，2022年，8月28日(1)从基因文库中获取目的基因4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本9页的相关内容，回答一下问题自主学习

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库部分基因组文库：基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.（如cDNA文库）第十二页，共六十七页，2022年，8月28日基因组文库与部分基因文库的关系第十三页，共六十七页，2022年，8月28日2.基因文库的构建方法（1）鸟枪法（2）反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法人工合成法（真核生物）多用于原核生物直接分离法第十四页，共六十七页，2022年，8月28日某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之第十五页，共六十七页，2022年，8月28日提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)第十六页，共六十七页，2022年，8月28日基因组文库和cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第十七页，共六十七页，2022年，8月28日（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成第十八页，共六十七页，2022年，8月28日上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因第十九页，共六十七页，2022年，8月28日思考：如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；

基因翻译产物蛋白质等特性。注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。第二十页，共六十七页，2022年，8月28日

概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA复制2、利用PCR技术扩增目的基因第二十一页，共六十七页，2022年，8月28日第二十二页，共六十七页，2022年，8月28日①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③前提：_______________________②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制指数2n要有一段已知目的基因的核苷酸序列自主学习阅读课本P10-P11页的相关内容，回答一下问题（2）利用PCR技术扩增目的基因第二十三页，共六十七页，2022年，8月28日四种脱氧核苷酸(dNTP)

一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：第二十四页，共六十七页，2022年，8月28日1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第二十五页，共六十七页，2022年，8月28日模板DNA95℃第二十六页，共六十七页，2022年，8月28日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第二十七页，共六十七页，2022年，8月28日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第二十八页，共六十七页，2022年，8月28日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第二十九页，共六十七页，2022年，8月28日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第三十页，共六十七页，2022年，8月28日

过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日2、具体过程第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日PCR(多聚酶链式反应) 第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日二、基因表达载体的构建——核心问题1．为何要构建基因表达载体？

问题2．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？问题3．基因表达载体的构建需要哪些工具酶，如何将目的基因与运载体连接起来形成重组DNA分子（以质粒为运载体）？问题4．将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？

小组讨论：第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日二、基因表达载体的构建

——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第四十页，共六十七页，2022年，8月28日①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日将目的基因导入受体细胞－转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术感受态法受体细胞植物cell动物cell原核cell第四十三页，共六十七页，2022年，8月28日植物肿瘤第四十四页，共六十七页，2022年，8月28日第四十五页，共六十七页，2022年，8月28日第四十六页，共六十七页，2022年，8月28日③过程：④优点:比较经济和有效适用于双子叶植物裸子植物第四十七页，共六十七页，2022年，8月28日种子植物裸子植物被子植物双子叶植物单子叶植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麦、玉米…双子叶植物－网状脉单子叶植物－平行脉第四十八页，共六十七页，2022年，8月28日适用于单子叶植物基因枪法第四十九页，共六十七页，2022年，8月28日（2）基因枪法（3）花粉管通道法适用于被子植物第五十页，共六十七页，2022年，8月28日2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物第五十一页，共六十七页，2022年，8月28日显微注射技术第五十二页，共六十七页，2022年，8月28日3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：

用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子第五十三页，共六十七页，2022年，8月28日四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功第五十四页，共六十七页，2022年，8月28日（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:第五十五页，共六十七页，2022年，8月28日归纳步骤第五十六页，共六十七页，2022年，8月28日DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究第五十七页，共六十七页，2022年，8月28日（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第五十八页，共六十七页，2022年，8月28日第五十九页，共六十七页，2022年，8月28日归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：第六十页，共六十七页，2022年，8月28日练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的

处，DNA连接酶作用于

处。（填“a”或“b”）aa第六十一页，共六十七页，2022年，8月28日练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和

法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用

技术，该技术的核心是

和

。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的

作探针进行分子杂交检测，又要用

方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养脱分化和再分化耐盐基因一定浓