纤维素乙醇发酵全详解演示文稿

纤维素乙醇发酵全详解演示文稿第一页，共七十五页。（优选）纤维素乙醇发酵全第二页，共七十五页。第二代生物燃料第二代生物燃料以秸秆、草和碎木等农业废弃物或非粮作物为主要原料，又被称为纤维素乙醇，或非粮生物燃料。第三页，共七十五页。与第一代生物燃料对比首先，汽车发动机不需要改造就可以直接使用掺入了生物乙醇的汽油或柴油；其次，生产第二代生物乙醇的催化酶技术未来几年成本还将快速下降，大规模工业生产的可行性非常强；第三，秸秆等纤维素类农业废弃物大量存在，比如中国每年农业生产大约产生7亿吨秸秆，供给非常充足。第四页，共七十五页。第五页，共七十五页。第六页，共七十五页。我国纤维素乙醇产业化发展现状河南天冠集团2006年6月26日，河南天冠集团建成投产了我国首条秸秆乙醇中试生产线，标志着我国在生物质能源利用领域已跻身世界行列。目前，在河南天冠集团，一条年产300t乙醇的中试生产线已建成投产，6t麦秸可变成1t乙醇。第七页，共七十五页。上海华东理工大学能源化工系，承担国家863项目的“农林废弃物制取燃料乙醇技术”研究，近年已进入工业性试验阶段。已建成年产燃料乙醇600t的示范工厂，接下来的问题就是如何产业化。第八页，共七十五页。国家科技支撑计划秸秆乙醇关键技术研究及产业化示范项目已于2008年6月上旬获得科技部批复，列入“十一五”国家科技支撑计划组织实施。中国科学院于2007年12月中旬启动“纤维素乙醇的高温发酵和生物炼制”重大项目。第九页，共七十五页。国外纤维素乙醇产业化发展现状第十页，共七十五页。第十一页，共七十五页。纤维素乙醇产业化亟待解决的关键技术第十二页，共七十五页。第十三页，共七十五页。国内外预处理方法的研究动态第十四页，共七十五页。第十五页，共七十五页。

纤维素酶的生产和纤维素水解技术研究纤维素酶高产菌种的筛选和诱变育种目前，用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌。研究得较多的有木霉属、曲霉属、青霉属等。其中木霉、青霉产生的纤维素酶活力往往最高，酶组分最全。因而应用也最广泛。曲霉和根霉产生的主要是内切型纤维素酶，多用于纺织和造纸等纤维的表面加工。纤维素酶生产技术纤维素酶的生产可采用液体培养和固体培养两类方法。我国采用的固体培养方法包括薄层的曲盘培养、帘子培养和厚层的通风培养等。生产上常用的是厚层通风培养，亦称厚层通风曲或箱曲，设备比较简单，易于推广，但容易污染杂菌，温度和湿度不易控制，大规模生产难于稳定。第十六页，共七十五页。在美国能源部的支持下，杰能科(GenencorInternational)和诺维信(NovozymesA／S)两家酶制剂公司加大了研究力度，努力增加酶活和降低生产成本，取得了引人注目的结果。诺维信鉴定出多种新酶，配制成新的复合酶制剂，提高了酶系的降解能力，结合NREL预处理技术的进步，使玉米秸产乙醇用酶的成本降至原来的1／30，从2001年的每加仑5美元到2005年的每加仑10—18美分。通过技术进步，杰能科的酶成本也降至原成本的1／30。美国能源部认为酶处理成本已不再是产业化的主要障碍。第十七页，共七十五页。乙醇发酵菌种选育及发酵过程调控——汪吴第十八页，共七十五页。理想的生物质乙醇发酵菌应能发酵所有生物质来源的糖，具有对木素单体、乙酸和其它抑制性副产物的良好抗性，并同纤维素完全水解所需的纤维素酶有协同作用。一、纤维素乙醇发酵菌种选育第十九页，共七十五页。从自然界中筛选戊糖发酵菌种诱变育种采用原生质体融合技术基因工程在菌种选育上的应用木糖发酵菌株选育方法第二十页，共七十五页。优点：简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。缺点：效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。自然筛选第二十一页，共七十五页。诱变育种化学诱变剂:硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺等物理诱变剂:如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波等营养缺陷型菌株的筛选抗性突变株的筛选温度敏感突变型筛选抗反馈调节突变株的筛选组成型突变株的筛选第二十二页，共七十五页。诱变育种实例樊梓鸾对热带假丝酵母2.402进行紫外诱变，通过初筛、复筛，获得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株UV2。在pH3.5和10％乙醇的培养基中，表现出良好的发酵性能。在此条件下进行乙醇发酵试验，乙醇转化率可达0.329g/g底物，同时诱变菌株与出发菌株相比，乙醇转化率提高了28.57%。连续传代10次发酵性能无明显变化，表明菌株具有一定的遗传稳定性。第二十三页，共七十五页。原生质体融合育种是杂交育种（基因重组）育种的一种特殊方式目前已经实现了树干毕赤酵母与酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精，其耐酒精的性能也比亲株有所提高。原生质体融合第二十四页，共七十五页。基因工程育种第二十五页，共七十五页。大肠杆菌等能有效地利用木质纤维素材料的所有糖组分，对乙醇也有一定耐性(高于50g/L)。但通常乙醇只是这些大肠杆菌产生的众多产物之一。乙醇高产的关键在于丙酮酸脱羧酶(PDC)、醇脱氢酶(ADH)系统。有人将运动发酵单胞菌编码PDC和ADH的基因(pdc和adhb)构建成称为PET的人造操纵子，用质粒转化大肠杆菌，并实现了高表达，从而将丙酮酸代谢导向产生乙醇。天然底物利用策略第二十六页，共七十五页。美国国家可再生能源实验室(NREL)的张敏等利用复杂的克隆技术，构建了带有两个独立操纵子的杂合穿梭质粒(pzB5)，分别编码大肠杆菌的xylA和xylB基因，以及转酮酶(tktA)转醛酶(tal)基因，成功地转化了运动发酵单胞菌CP4菌株。重组菌利用木糖作为唯一碳源生长，能有效地转化理论得率82%~87%的木糖和葡萄糖为乙醇。重组菌底物利用策略第二十七页，共七十五页。樊梓鸾研究了高产乙醇酵母菌株的诱变育种筛选产乙醇能力强的出发菌株细胞悬浮液的制备紫外照射绘制致死曲线，确定最大正突变的照射剂量挑选菌株影印培养初筛复筛发酵试验菌株稳定性实验。高产乙醇菌种选育第二十八页，共七十五页。供试菌种：南阳酵母2.606(Saccharomycescerevisiae)，热带假丝酵母2.637(Candidatropicalis)，热带假丝酵母2.402(Candidatropicalis)YEPD液体培养基:酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。利用杜氏管测定三种酵母在葡萄糖发酵培养基和混合糖发酵培养基中的呼吸情况，从而确定菌株生产乙醇的能力A:筛选产乙醇能力强的出发菌株选取热带假丝酵母2.402为出发菌株第二十九页，共七十五页。B:紫外诱变——诱变剂量的选择最佳诱变时间为30s，致死率为80.30%第三十页，共七十五页。C:酵母菌一级筛选（TTC法）TTC是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一种显色剂，它能对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产乙醇能力的高低。得到25株酵母菌，随机编号UV1~UV25诱变后菌株TTC下层平板比较菌落颜色影印平板30℃，24h倒入TTC上层培养基30℃，2~3h第三十一页，共七十五页。D:酵母菌二级筛选（杜氏小管法）（1）酵母代谢木糖和葡萄糖混合糖的驯化实验14株第三十二页，共七十五页。（2）酵母耐酸试验8株第三十三页，共七十五页。（3）酵母耐乙醇试验第三十四页，共七十五页。E:酵母菌三级筛选(C02失重法)以UV2号菌株为最终发酵用菌株。第三十五页，共七十五页。F:糖浓度对乙醇产率的影响第三十六页，共七十五页。G:诱变菌株UV2的遗传稳定性试验小结：从优良稳定的南阳酵母2.606，热带假丝酵母2.637和2.402中筛选出可同时糖化五碳糖和六碳糖，且乙醇产率较高的热带假丝酵母2.402进行紫外诱变，通过初筛、复筛，获得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株。在pH3.5和10%乙醇的培养基中，表现出良好的发酵性能。在此条件下进行乙醇发酵试验，乙醇转化率可达0.329g/g底物，同时诱变菌株与出发菌株相比，乙醇转化率提高了28.57%。连续传代10次发酵性能无明显变化，表明菌株具有一定的遗传稳定性。第三十七页，共七十五页。纤维素糖化发酵工艺同步糖化发酵法（SSF)分批补料技术和纤维素-淀粉共发酵水解发酵二段法（SHF)第三十八页，共七十五页。定义：将纤维素先用纤维素酶糖化，再经酵母发酵成酒精的方法。优点：可以分别使用水解和发酵各自的最适条件(分别为50℃和30℃)。缺点：酶水解产生的产物(纤维二糖和葡萄糖)会反馈抑制水解反应水解发酵二段法（separatehydrolysisandfermentation,SHF）第三十九页，共七十五页。SHF方法的改进Ghose等将高产菌株绿色木霉QM9123的纤维素酶浓缩5~8倍，加入30%研磨的木质纤维素悬浮液，在反应器内连续糖化，将生成的葡萄糖通过超过滤膜分离出去，从而消除产物抑制，提高了反应速度，流出液的葡萄糖浓度达10%以上。但膜技术产业化有一定困难。第四十页，共七十五页。纤维素酶水解和菌体酒精发酵同时进行的方法。优点：在加入纤维素酶的同时接种酒精发酵的酵母，可使生成的葡萄糖立即被酵母发酵成酒精；去除了产物抑制，就可以不妨碍纤维素糖化的继续进行，酒精得率可明显提高。关键：选择最适的酵母，酶解的最适温度约为50℃，而普通酿酒的最适发酵温度通常约30℃。同步糖化发酵(simultaneoussaccharificationandfermentation,SSF)第四十一页，共七十五页。SSF实例彭林才等人以卫生纸厂初级污泥作为生物质原料，采用同步糖化发酵法生产燃料乙醇，经过条件优化乙醇质量浓度达19.5g/L，是理论值的63.9%。第四十二页，共七十五页。同步糖化共发酵(simultanenoussaccharificationandcofermentation,SSCF)利用能同时发酵戊糖和己糖的稳定的基因重组菌株进行同步共发酵。实例：在中试条件下，经过稀酸预处理的玉米纤维在总固体物浓度为20%、纤维素酶用量为10IFPU/g纤维素、30℃、150rpm、pH5.0条件下，使用普度大学构建的重组酵母LNH-ST菌株进行同步糖化共发酵4天，78.4%的可用葡萄糖和56.1%的可用木糖被转化成乙醇。第四十三页，共七十五页。微生物直接转化法(consolidatedbioprocessing,CBP)纤维素酶的生成和乙醇发酵由一种微生物或一个微生物群体来实施。CBP需要的菌株可以通过代谢途径工程方法构建。实例1：Ingram等将欧文氏菌(Erwinia)的两种内切葡聚糖酶的基因克隆到能生产乙醇的克雷伯氏菌(Klebsiella)中，使该菌配合真菌纤维素酶发酵纤维素产生的乙醇增加了22%。第四十四页，共七十五页。CPB实例2——粗糙脉胞菌AS31602发酵生产乙醇粳糙脉孢菌(Neurosporacrassa)AS3.1602具有同时产生纤维素酶、半纤维素酶、发酵葡萄糖和木糖的能力。张志华对N.crassaAS3.1602好氧产酶和厌氧直接发酵纤维素产生乙醇的过程进行了代谢分析。以20g/L的微晶纤维素为碳源进行产酶培养，好氧发酵3d时，菌体处于稳定期，FPA酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活都处于较高水平。厌氧条件下直接转化20g/L的微晶纤维素，发酵96h时乙醇浓度可以达到6.3g/L，仅检测到少量副产物乳酸和乙酸。第四十五页，共七十五页。分批补料技术和纤维素一淀粉共发酵山东大学利用造纸厂废水中回收的细杂纤维进行的酶解产酒精实验显示，使用15FPAIU/g纤维素的纤维素酶，起始纤维废渣浓度10g/100ml(已呈半固态，没有多少游离水)，酒醪的酒度也只能达到2.5%~2.7%(V/W)。在36h时补加10g纤维废渣，不要再加纤维素酶，就可继续发酵。最终酒度可以达到5%(V/W)左右。第四十六页，共七十五页。发酵过程调控对于不同的发酵工艺，其具体影响因素不同，影响发酵过程的主要因素有：发酵温度发酵时间纤维素酶用量菌种接种量菌液浓度底物浓度第四十七页，共七十五页。实例1：SSF纤维素转化乙醇最佳工艺参数确定单因素实验结果第四十八页，共七十五页。正交实验结果在最优条件下，乙醇转化率可达0.368g/g底物，比优化前的乙醇转化率提高了10.60%，较出发菌株提高了36.14%。第四十九页，共七十五页。纤维素发酵生产乙醇工艺示意图第五十页，共七十五页。葡萄糖发酵途径EMP、HMP、ED和PK

第五十一页，共七十五页。由葡萄糖到形成丙酮酸的一系列反应称糖酵解，又称EMP途径。糖酵解作用一般在无氧情况下进行，故又称无氧分解。第五十二页，共七十五页。用酵母使糖变为乙醇的工程称为生醇发酵。酵母等能使丙酮酸脱羧成乙醛，乙醛在醇脱氢酶催化下被NADH还原成乙醇。

该过程只在pH3.5~4.5以及厌氧的条件下发生。第五十三页，共七十五页。当发酵液处在碱性条件下，酵母的乙醇发酵会改为甘油发酵。原因：该条件下产生的乙醛不能作为正常受氢体，结果2分子乙醛间发生歧化反应，生成1分子乙醇和1分子乙酸；CH3CHO+H2O+NAD+CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+CH3CH2OH+NAD+

此时也由磷酸二羟丙酮担任受氢体接受3-磷酸甘油醛脱下的氢而生成-磷酸甘油，后者经-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。2葡萄糖2甘油+乙醇+乙酸+2CO2第五十四页，共七十五页。戊糖磷酸途径（HMS），约有30%的葡萄糖可能由此途径进行氧化。第五十五页，共七十五页。ED途径

是少数缺乏完整EMP的微生物具有的一种替代途径。关键反应：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解相关的发酵生产：细菌酒精发酵优点：代谢速率高，产物转化率高，菌体生成少，代谢副产物少，发酵温度较高，不必定期供氧。缺点：较易染菌；细菌对乙醇耐受力低第五十六页，共七十五页。酵母菌（在时）的乙醇发酵

~脱羧酶~脱氢酶丙酮酸→乙醛→乙醇通过EMP途径产生乙醇，总反应式为：C6H12O6+2ADP+2Pi→2C2H5OH+2CO2+2ATP

细菌的乙醇发酵通过ED途径产生乙醇，总反应如下：葡萄糖+ADP+Pi→2乙醇+2CO2+ATP细菌的乙醇发酵通过HMS途径产生乙醇、乳酸等，总反应如下：葡萄糖+ADP+Pi→乳酸+乙醇+CO2+ATP第五十七页，共七十五页。由表可见，在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。第五十八页，共七十五页。木糖代谢途径传统的用于发酵生产的微生物（酿酒酵母和运动发酵单胞菌等）能很好地利用葡萄糖，且乙醇发酵率高，乙醇耐受力强，但均缺少利用木糖的能力。因此近些年来，人们尝试利用代谢工程手段改造酵母菌或者细菌来发酵木糖等五碳糖生产酒精。第五十九页，共七十五页。代谢工程（metabolicengineering）代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用重组DNA为主的技术，操纵酶的转移和细胞调节功能，定向改造基因组结构，重新设计细胞的代谢系统，达到生物体内改变代谢流，扩展代谢途径和构建新的代谢途径的目的。第六十页，共七十五页。代谢工程具体思路1、改变代谢流1）加速速度限制反应2）改变分支代谢途径流向3）构建代谢旁路4）改变能量代谢途径2、扩展代谢途径和构建新的途径1）延伸代谢途径2）构建新的合成途径第六十一页，共七十五页。ACBDEFGHJIK中心代谢途径收敛途径发散途径指向中心代谢途径，并以中心代谢途径中间化合物为接口的途径。代谢网络组成的途径类型以中心代谢途径的中间化合物为起点，并由中心代谢途径向周围分散的途径第六十二页，共七十五页。代谢分析中研究方法图细胞在不同水平上对基因改变和环境变化的响应，对于不同水平上各自的高通量研究方法为分析细胞的代谢提供了大量的信息第六十三页，共七十五页。S.Cerevisiae对不同氮源的吸收利用的途径与机理

谷氨酸和谷氨酰胺在氮代谢中起着重要的作用，氨、谷氨酸和谷氨酰胺之间的相互转化被称为氮的中间代谢途径(CNR)，如图所示