植物生物技术论文（精选范文8篇）,生物技术论文

植物生物技术论文〔精选范文8篇〕,生物技术论文CRISPR/Cas9是由crRNA，反式激活crRNA(trans-activatIngcrRNA,tracrRNA)和Cas蛋白3部分组成，3部分在DNA构造上依次排列并构成tracrRNA,crRNA以及Cas9蛋白构成复合物，使其在特定的靶位点进行切割。Cas9蛋白含有HNH和RuvC功能域，HNH负责剪切与crRNA互补的DNA链，RucV负责剪切双链DNA的另一条链(图3)。由间隔序列相邻基序(protospaceradjacentmotIf,PAM)指导Cas9蛋白能够精准的切割外源DNA。PAM位于结合区域的上游并与结合区域相邻，通常是NGG(N为任意核苷酸，G为鸟嘌呤)3个碱基。在实际操作中，为了愈加简单的操作，Jinek等通过接头将crRNA和tracrRNA合并成为1条RNA链，进而构成单一指导RNA(single-guideRNA,sgRNA)。人工设计gRNA时，结合的区域也就是20nt，其位于gRNA的5末端，作为指导序列靶序列互补配对。简单来讲，改造后的CRISPR/Cas9系统仅需要在sgRNA指导下，就能完成Cas9蛋白对特定位点的剪切。CRISPR/Cas9系统能够分为3类，分别是TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，TypeⅠ类型普遍存在于Cas3蛋白，Cas3是一种解旋酶/核酸酶，但是与DNA核酸酶和解旋酶活性不同。TypeⅡ类型是Cas9蛋白所必需的，其包含Ruvc构造域和HNH构造域，这2个构造域对Cas9内切酶活性至关重要。TypeⅢ类型需要大量的RAMP蛋白、Cas6和Cas9蛋白介入到crRNA对目的DNA的切割。TypeⅢ类型不需要辨别外源DNA序列上的PAM序列，但仍有降解外源DNA的能力，进而使其成为一个非特异性系统。1.3CRISPR/Cas9系统作用原理CRISPR/Cas9能够产生与目的序列互补的RNA序列，并通过碱基互补配对的方式构成RNA-DNA构造，之后，使Cas9核酸内切酶对靶DNA剪切构成双链断裂的DNA(doublestrandbreak,DSB)。产生的DSB能够通过同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)途径修复，可以以通过非同源末端链接(nonhomologousend-joining,NHEJ)途径修复。CRISPR/Cas9系统的作用机制能够总结为下面3步。1.3.1第1步外源DNA的入侵，外来的DNA首先被Cas蛋白辨别，并随后整合到CRISPR位点的2个相邻的重复序列之间的间隔。1.3.2第2步CRISPR-RNA的产生，当外源物质再次入侵时，整合了外源DNA片段的CRISPR基因座转录生成precrRNA和tracrRNA,pre-crRNA被核酸酶Ⅲ与tracrRNA切割构成成熟的cr-RNA[9]。1.3.3第3步CRISPR/Cas9系统剪接，pre-crRNA和crRNAs构成复合物，通过碱基互补配对原则特异性辨别外来的DNA(或RNA)，这种复合物降解外来DNA并维持噬菌体的免疫，除此之外，Cas9蛋白还能够与复合物构成结合，辨别外来DNA序列上的PAM序列，行驶剪接功能(图2)。2CRISPR/Cas9在植物中的应用2.1基因敲除CRISPR/Cas9导致特定基因下调或毁坏目的基因的表示出，在很多植物中成功应用。如在玉米上，美国杜邦公司利用CRISPR/Cas9技术成功敲除玉米中编码淀粉合成酶的糯质基因Wx1，进而培育出新的糯玉米品种[11]。在水稻上，CRISPR/Cas9诱导水稻转录因子编码基因OsERF922的靶向突变，进而加强其对稻瘟病真菌病原体的抗性[10]。利用水稻密码子优化Cas9基因，采用水稻U3启动子启动sgRNA转录，对水稻中的PDS基因定点突变，获得了纯合的基因敲除突变体[6]。在番茄上，用CRISPR/Cas9技术敲除番茄slmapk3基因，相对于野生型植株，突变体表现出严重的叶片枯萎和弯曲，因而能够更深切进入地了解SlMAPK3基因介导的干旱调控机制[12]。图2CRISPR/Cas9编辑靶基因的示意图[18]2.2同时编辑多个基因座随着CRISPR/Cas9系统的在植物中不断的应用，其能够实现对多个基因同时编辑。该作用的发挥需要Cas9与多种不同的sgRNA融合来实现。如，嵌合导向RNA(cgRNA)能够靶向小麦中2种不同的基因肌醇加氧酶(inositoloxygenase,inox)和八氢番茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase,pds)基因[13]。2.3基因置换利用CRISPR/Cas9技术能够实现靶基因置换或敲入，将外源DNA整合到基因组中所需的位点。如，将潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycinphosphotransferase,HPT)通过同源重组的方式方法成功整合到大豆的第4条染色体上[14]。基因置换能够通过Cas9-sgRNA载体共转化实现，或者通过合成含有供体序列或与单一供体序列的Cas9-sgRNA的表示出盒。2.4产生无标记的转基因植物转基因能够将外源基因随机的整合到染色体上，还能够通过水平基因转移到同一物种的非转基因植物或者其它物种的植物上。然而，CRISPR/Cas9基因编辑系统能够避免这种现象发生，sgRNA与Cas9构成复合体，指导Cas9对特定序列进行精到准确突变，其作用对象不是整条染色体。CRISPR/Cas9复合体会在细胞内降解，不会遗传给下一代。已经在小麦中利用CRISPR/Cas9引入DNA或RNA，并通过瞬时转化愈伤组织细胞的方式方法，能够得到无转基因的、纯合的T0代小麦突变体[15]。3基因编辑与传统转基因技术的比拟转基因技术(TransgenticTechnology)是指从植物中分离得到或经过修饰的目的基因导入到植物体内，使其在植物体内稳定表示出和遗传。简单讲，转基因是将外源DNA随机整合到染色体上，所以，转基因技术无论是在经过中还是在最后得到的植株中都会牵涉外源DNA的导入。利用CRISPR/Cas9在最后得到的植株中不存在外源DNA，是将DNA序列插入到染色体的特定位置上与传统的育种方式得到的植株无法区分，所以，基因编辑技术相对更容易被接受且更安全。美国农业部公布，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术的到的蘑菇和玉米不属于转基因监管的范围[16];利用CRISPR/Cas9基因编辑技术能够精到准确目的位点，使基因型与表型联络起来，减少了挑选转基因植株导致的DNA随机插入的样本数量，进而能够确切的判定基因的功能，使研发时间和成本有所下降。总之，利用基因编辑得到植物中不含有转基因成分，相比之下，更容易被人们接受。4基因编辑植物检测方式方法利用CRISPR/Cas9系统剪切的DNA双链，经过细胞的自我修复，将DNA双链连接起来，没有牵涉到外源基因的参加，获得的植物中不带任何标记，与经过基因突变的植物并无明显区别。当前对基因编辑植物检测最常用的方式方法是PCR/RE。利用该方式方法需要知足的条件是gRNA靶序列内存在限制性酶切位点。经基因编辑得到的阳性植株靶序列的酶切位点突变，而不能被内切酶辨别，而野生型植株中存在酶切位点能够被相应的酶辨别。该方式方法能够检测单等位基因和双等位基因突变，但是不能区分双等位基因纯合子或杂合突变体[17]。还有一种检测方式方法-Sanger测序法，该方式方法在检测植物编辑中也较为常用。但是该方式方法只能确定靶序列能否发生突变，不能对突变类型进一步确定。PCR-Sequencing最终也是利用Sanger法，该技术通过对PCR产物测序，对测序结果的峰值进行比拟，确定基因组位点能否发生突变[18]，固然这种方式方法确定突变位点较为精到准确，但是此方式方法费时、费力，只适用于对少量的靶位点进行分析，对于公司或者大批量检测基因编辑来讲效率不高。CRISPR/Cas9作为第3代基因编辑系统，最近几年的迅速发展和应用领域的拓展，其在基因编辑的精到准确性和高效性方面已经不可替代，遭到科研人员的重视和关注。利用基因编辑技术得到的植物新品种中不存在外源DNA，能够使植物的培育经过愈加安全。开发出一个省时、省力、高效的方式方法来检测基因编辑的植物，这也使科研人员所面临更大的挑战。5瞻望CRISPR/Cas9作为一种操作简单、有效、精到准确度高的基因编辑技术，广泛应用于各个领域。尽管CRISPR/Cas9被成功用于植物基因组编辑，但也存在很多风险。如，最小化脱靶机制，并阐述这种机制，怎样对CRISPR/Cas9系统进行优化，以及开发出一种对植物基因组编辑检测的有效方式方法。这需要对CRISPR/Cas9系统进行愈加深切进入的研究，以促进CRISPR/Cas9基因编辑技术在将来会创造更大的价值。以下为参考文献[1]IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct[J].JournalofBacteriology,1987,169(12):5429-5433.[2]JansenR,EmbdenJD,GaastraW,etal.IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes[J].MolecularMicrobiology,2002,43(6):1565-1575.[3]BolotinA,QuinqusisB,SorokinA,etal.Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromerepeats(CRISPRs)havespacersofextrachromosomalorigin[J].Microbiology,2005,151(8):2551-2561.[4]BrounsS,JoreM,LundgrenM,etal.SmallCRISPRRNAsGuideAntiviralDefenseinProkaryotes[J].Science,2008,321(5891):960-964.[5]JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity[J].Science,2020,337(6096):816-821.[6]ShanQ,WangY,LiJ,etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPR-Cassystem[J].NatureBiotechnology,2020,31(8):686-688.[7]BursteinD,HarringtonL,StruttS,etal.NewCRISPR-Cassystemsfromuncultivatedmicrobes[J].Nature,2021,542(7640):237-241.[8]YangJ,LiJ,SuzukiK,etal.Geneticenhancementinculturedhumanadultstemcellsconferredbyasinglenucleotiderecoding[J].Cellresearch,2021,27(9):1178-1181.[9]LanderES.TheHeroesofCRISPR[J].Cell,2021,164(1-2):18-28.[10]WangF,WangC,LiuP,etal.EnhancedRiceBlastResistancebyCRISPR/Cas9-TargetedMutagenesisoftheERFTranscript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