高中生物新人教版选择性必修33.2基因工程的基本操作程序学案

第2节基因工程的基本操作程序课堂互动探究案课程标准阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。素养达成1.结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维)2．针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。(科学探究)我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？探究点一目的基因的筛选与获取【师问导学】巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而达到减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播的目的。请讨论回答下列问题。1．该项研究的目的基因是什么？其作用是什么？2．根据PCR获取和扩增目的基因的反应条件，完善表格。条件作用在一定的缓冲液中进行提供相对稳定的________环境____________合成DNA子链的原料DNA母链______________________________催化合成DNA子链________与DNA母链相应互补序列结合3.PCR反应的过程过程说明图解____温度上升到90℃以上，双链DNA________为单链____温度下降到50℃左右，两种引物通过__________与两条单链DNA结合____温度上升到72℃左右，耐高温的DNA聚合酶从引物起始合成互补链，可使新链由________________【智涂笔记】[总结归纳]目的基因获取方法的选择(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。(3)如果只知道待扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可通过PCR技术扩增目的基因。4.PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？5．PCR过程中为什么需要引物？6．什么样的基因适合用DNA合成仪直接人工合成？[易错警示]PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。【师说核心】1．筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2．从基因文库中获取目的基因(1)基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)基因文库的种类①基因组文库：包含一种生物所有的基因。②部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。说明：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。(3)从基因文库中获取目的基因的方法根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。3．利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR技术：PCR是多聚酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)PCR原理：DNA双链复制。(3)前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列(以便根据这一序列合成引物)。(4)扩增过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。如图所示。注意：利用PCR技术扩增目的基因可以在PCR扩增仪中自动完成。4．用化学方法人工合成目的基因(1)条件：基因比较小，且核苷酸序列已知。(2)仪器：DNA合成仪。5．PCR技术扩增与DNA复制的比较项目DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶(Taq酶)温度条件细胞内的温度条件需控制温度，在较高温度下进行合成的对象DNA分子DNA片段或基因联系①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成；②原料：均为四种脱氧核苷酸；③酶：均需要DNA聚合酶进行催化；④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。【检测反馈】1．下列关于基因文库的说法中，正确的是()A．cDNA文库中的基因也有启动子B．一种生物的cDNA文库只有一种C．基因组文库的基因都可以在物种间进行基因交流D．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因2．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法获得cDNA④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③3．如图为基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。相关叙述中正确的是()A．这三种方法都是在体内进行的B．①②③碱基对的数量和排列顺序相同C．方法a和c均用到DNA聚合酶D．方法c需要模板4．下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是()A．片段a、b、c的长度均相同B．片段a、b只是第一次循环的产物C．片段c最早出现在第二次循环的产物中D．经过30次循环后，片段c的数量为230探究点二基因表达载体的构建【师问导学】1．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么基因表达载体中还需要加入启动子、终止子、标记基因等元件？2．启动子和起始密码子有什么区别？终止子和终止密码子有什么区别？3．为什么处理目的基因和载体(质粒)的限制酶一般是同一种限制酶？4．标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？5．培育转基因生物的核心工作是什么？构建基因表达载体的目的是什么？6．为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？【智涂笔记】[易错警示]基因表达载体易错点剖析(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。(3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。[教材延伸]目的基因是否导入受体细胞中还需要有标记基因作为筛选标记。一般情况下，质粒载体有1～2个标记基因，为受体细胞提供易于检测的表型特征。由于构建基因表达载体的目的不同，需要的标记基因也不同。有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是人为加上去的。【师说核心】1．基因表达载体的构成2．基因表达载体构建时有关限制酶的选择选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使用限制酶SmaⅠ切割，因为会破坏标记基因。3．基因表达载体中启动子、终止子的来源(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。4．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束【检测反馈】1．下列有关基因表达载体构建的说法，错误的是()A．基因表达载体的构建是实施基因工程的核心B．构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，并且使目的基因能够表达和发挥作用C．启动子存在于基因的编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录D．标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因2．请据图回答下列问题：(1)基因工程的核心步骤是________________________________________________________________________。(2)利用________技术可以获得大量的目的基因。该技术利用________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈指数增长。(3)图中________位于基因的首端，是________________识别和结合的部位。抗生素抗性基因的作用是作为________，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因。探究点三将目的基因导入受体细胞【师问导学】1．农杆菌转化法的分析(1)农杆菌向植物细胞移动的原因是什么？(2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？(3)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上？2．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。3．为什么动物的体细胞一般不作为受体细胞？4．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？但若通过基因工程生产人的糖蛋白，从细胞器的功能分析是否可用大肠杆菌作为受体细胞呢？5．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。6．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？【智涂笔记】[易错警示]1．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。2．微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。将基因表达载体(重组质粒)导入微生物细胞的常用方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)。3．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。【师说核心】1．转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。名师提醒：(1)此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同。(2)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。2．常用的转化方法受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物基因枪法将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中→目的基因整合并表达成本较高，常用于单子叶植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创的一种方法动物细胞显微注射技术将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法微生物细胞Ca2＋处理法(感受态细胞法)用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效3.受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。4．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。【检测反馈】1．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是()A．利用基因枪法将目的基因导入植物细胞的方法比较经济、有效B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法2．科学家采用基因工程技术将矮牵牛中控制蓝色色素合成的基因G转移到玫瑰中，以培育蓝玫瑰。下列操作正确的是()A．将基因G直接导入土壤农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞B．将基因G导入玫瑰细胞后，即可通过植物组织培养培育出蓝玫瑰C．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得DNA，再扩增基因GD．将基因G导入玫瑰细胞液泡中，防止其经花粉进入野玫瑰3．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射技术D小麦细胞基因枪法4.(多选)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程示意图。下列叙述正确的是()A．过程a需要限制酶和DNA连接酶的参与B．过程b需要用CaCl2处理，以提高农作物细胞细胞壁的通透性C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定

探究点四目的基因的检测与鉴定【师问导学】一、目的基因在受体细胞内能够维持稳定和表达其遗传特性，需要逐步进行检测。示意图如下：目的基因的检测示意图[思考交流]1．上图采用________技术，目的是要检测什么？2．什么是基因探针？3．如果要检测目的基因是否转录出了mRNA，需要采用________技术，与基因探针杂交的是什么物质？4．检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用________法。具体做法又如何？二、下图为抗虫棉的接种实验，结合图示(左图为抗虫转基因棉使虫体发育不正常)探究以下问题：1．判断抗虫棉的接种实验属于__________鉴定。2．检测方法是______________________，观察指标是________。【智涂笔记】[易错提醒]1．基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。2．关于不同分子水平检测的原理、场所、探针的异同(1)原理：进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，都遵循碱基互补配对原则，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。(2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。(3)探针：在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。【师说核心】1．操作目的目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否做成功的一步。2．目的基因的检测与鉴定归纳3．目的基因的检测与鉴定的方法比较类型检测内容方法结果显示分子水平检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带目的基因是否转录出mRNA核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间)个体生物学水平鉴定是否具有抗性及抗性程度对转基因生物进行抗性的接种实验是否赋予了预期抗性或蛋白质活性基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同比较基因工程产品与天然产品的功能活性4.常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。转基因生物检测方法观察目标抗虫植物害虫吞食害虫死亡抗病毒(菌)植物病毒(菌)感染未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较细胞产物功能活性正常【检测反馈】1．下列关于目的基因表达情况检测与鉴定方法中错误的是()A．用显微镜观察染色体的形态和结构，从而检测受体细胞是否导入了目的基因B．采用分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNAC．用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质D．做抗虫或抗病的接种实验检测转基因生物是否具有抗性以及抗性的程度2.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图，以下相关叙述，正确的是()A．①→②过程中使用了限制酶和DNA聚合酶B．③→④过程利用了细胞膜的结构特性，在光学显微镜下观察③细胞中的重组Ti质粒是筛选标志之一C．应用DNA探针技术，可检测④细胞中目的基因是否表达D．一般情况下，⑤只要表现出抗虫性状，就表明植株发生了可遗传变异3．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是()A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带4．研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段分别制成探针，与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交，结果如下表所示。下列叙述正确的是()探针乳腺细胞口腔上皮细胞蹄部细胞乳铁蛋白肽基因探针出现杂交带未现杂交带未现杂交带人干扰素基因探针出现杂交带出现杂交带出现杂交带A.乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达B．人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达C．表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同D．乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段【网络建构】【主干落实】1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。2．目的基因是指编码蛋白质的基因和具有调控作用的因子。其获取方法有：(1)从基因文库中获取；(2)利用PCR技术获取；(3)人工合成。3．基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点组成。4．将目的基因导入植物细胞的方法有：(1)农杆菌转化法；(2)基因枪法；(3)花粉管通道法。5．将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。6．目的基因的检测方法有DNA分子杂交技术、核酸分子杂交技术和抗原—抗体杂交技术。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。

1.实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是()A．95℃时DNA的磷酸二酯键断开B．引物与模板结合后向5′方向延伸C．反应过程包括变性→复性→延伸D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶2．土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，其中的T－DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程手段获取抗旱植株，以下分析不合理的是()A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T－DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T－DNA的基因片段不被破坏B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌C．用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞后，可通过植物组织培养技术得到具有抗旱基因的植物D．若能在植物细胞中检测到抗旱基因，则说明该基因工程项目获得成功3．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示。根据题意，回答下列问题：(1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：____________________、____________________、____________________、____________________。(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA________________________________的特点。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是____________________________。(5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是________________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________________。(一)从社会中来提示：参见本节正文中的内容。(二)旁栏思考题1．提示：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子(如图)。2．提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。(三)到社会中去1．提示：这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境。始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。(四)练习与应用概念检测1．(1)√(2)×(3)×2．D拓展应用1．提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。2．(1)提示：crtⅠ基因和psy基因pmi基因将目的基因送入水稻细胞。(2)提示：不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。(3)提示：维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。(五)探究·实践1．提示：可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。2．提示：一条条带。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：模板DNA污染；引物设计不合理；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。第2节基因工程的基本操作程序互动·探究·智涂探究点一【师问导学】1．提示：植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播。2．pH4种脱氧核苷酸提供DNA复制的模板耐高温的DNA聚合酶引物3．变性解旋复性碱基互补配对延伸5′端向3′端延伸4．提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。5．提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。6．提示：基因比较小，核苷酸序列又已知。【检测反馈】1．解析：cDNA文库中的基因都没有启动子，只包含基因中的外显子，A错误；由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，而基因组文库中含有某种生物的全部基因，因此只有一种，B错误；由于生殖隔离，基因组文库的基因在不同物种之间只有部分基因能进行基因交流，C错误；cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，D正确。答案：D2．解析：可依据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物蛋白质等从基因文库中获取目的基因，故①不需要模板；利用PCR技术扩增目的基因需要DNA的两条链作为模板；反转录法获得cDNA需要mRNA作为模板；通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因时，不需要模板。答案：D3．解析：题中三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶，方法b需要限制酶，方法c需要DNA聚合酶)，A错误、C正确。方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的数量和排列顺序不相同，B错误。方法c不需要模板，D错误。答案：C4．解析：图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D不正确。答案：C探究点二【师问导学】1．提示：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。2．提示：启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA序列，分别位于基因的首端和尾端，分别负责调控基因转录的开始和结束。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三个相邻的碱基序列，分别决定翻译的起始和终止。3．提示：用同一种限制酶处理可以获得同一种黏性末端，以便于将二者连接起来。4．提示：标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用抗性基因作为标记基因。5．提示：培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的：(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。6．提示：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。【检测反馈】1．解析：基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心；构建基因表达载体是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用；启动子存在于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录，最终翻译出蛋白质；载体上标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因。所以只有C项是错误的。答案：C2．解析：本题考查基因表达载体的组成及其构建。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；获取目的基因的方法有很多，其中PCR技术能迅速获得大量的目的基因，依据的原理是DNA的半保留复制；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、终止子等，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录出mRNA，抗生素抗性基因作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。答案：(1)基因表达载体的构建(2)PCRDNA的半保留复制(3)启动子RNA聚合酶标记基因探究点三【师问导学】1．(1)提示：当双子叶植物或裸子植物细胞受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类物质，吸引农杆菌移向这些细胞。(2)提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。(3)提示：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。2．提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。3．提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。4．提示：微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。不可以用大肠杆菌作为生产人糖蛋白的受体细胞，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。5．提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。6．提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。【检测反馈】1．解析：将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济、有效。此外，将目的基因导入植物细胞的方法还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程。答案：A2．解析：目的基因需要和载体连接形成重组质粒后再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，A错误；将基因G导入玫瑰细胞后，还要检测和筛选出含有目的基因的受体细胞，然后再通过植物组织培养培育出蓝玫瑰，B错误；提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录得到DNA，然后扩增，可获得大量的基因G，方法为逆转录法，C正确；细胞液泡中不含基因，因此不能将基因G导入液泡中，可将基因G导入叶绿体或线粒体中，这样可防止其经花粉进入野玫瑰，D错误。答案：C3．解析：花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入大肠杆菌，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法将目的基因导入受体细胞，D正确。答案：B4．解析：题图中过程a为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞(原核细胞)细胞壁的通透性