《细胞生物学实验》课件

一、实验目的1.熟悉并理解细胞膜选择透性这一细胞基本生理活动。2.了解各类物质进入细胞的速度。实验四细胞膜的渗透性《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第1页!二、实验原理细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构，它可选择性地让某些物质进出细胞。而对于不同性质的物质，细胞膜的通透性是大不一样的。当细胞与所处的环境存在渗透压差别时，水分子可从渗透压低的一侧向高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，细胞会失水而皱缩；而在低渗环境中，细胞会吸水膨胀直至破裂。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。溶血（hemolysis）:红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第2页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第3页!三、实验用品（一）仪器50ml烧杯10ml移液管试管《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第4页!（三）材料鸡红细胞悬液《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第5页!（二）低渗溶液

取试管一支加入10ml蒸馏水，然后再加入1ml稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第6页!2.取试管一支加入0.17mol/L氯化铵溶液10ml，再加入1ml稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入1ml稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第7页!五、实验结果将观察到的现象记录，并进行分析、比较：1.试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。2.如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。3.如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第8页!七、问题1、为什么我们检查细胞膜渗透性的试剂是一定浓度的，如：0.17mol/L的氯化钠，为什么设定为这个浓度？2、解释快速溶血的原因，乙醇和丙醇。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第9页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第10页!二、细胞培养定义：1.原代培养（primaryculture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。2.传代培养(subculture):培养细胞的生存环境是瓶皿或其他容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖到一定密度后，需要分离出一部分细胞并更新营养液，这一过程称为传代。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第11页!三、细胞培养技术的基本概念

（一）动物细胞培养另一种分类方式将细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层（贴壁培养）；另一种是克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第12页!

目前实验室中常用的几种细胞系

细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞人BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第13页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第14页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第15页!实验内容安排一、细胞培养准备工作（清洗）二、细胞培养准备工作（消毒、灭菌）三、培养基的配制四、细胞传代培养五、死活细胞的鉴别《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第16页!二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第17页!四、仪器、材料和试剂（一）仪器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器（二）材料紫外灯、微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um(三）试剂75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH等《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第18页!（二）Tip和Tube的清洗

（1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。（2）使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液2~24h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第19页!配制方法：（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第20页!（3）干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保温90~120min。用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温5~8h.（4）湿热灭菌也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。（5）滤过灭菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第21页!实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养二、培养基的配制《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第22页!三、仪器、材料和试剂超净工作台微孔过滤器（0.22um）高压灭菌锅蒸馏水器磁力搅拌器天平超低温冰箱二氧化碳培养箱（一）仪器《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第23页!（三）试剂HCl、NaOH、酚红RPMI1640干粉小牛血清、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺NaHCO3、胰酶三蒸水《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第24页!（二）合成培养基（RPMI1640）的配制

配制100mlRPMI1640母液：1、每4小组合称RPMI1640干粉1.04g，溶于100ml的3DW。2、置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第25页!（三）小牛血清的处理新买的新生小牛血清一定要灭活；将新生小牛血清不开封置于56℃水浴锅中30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。已灭活的血清贮存于4℃。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第26页!2．谷氨酰胺储备液（200mM）：

1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（30mg/ml=200mM),0.22um过滤至1.5ml离心管中。-20℃贮存。注：200mM=200mmol/L（毫摩尔每升)《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第27页!4.RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液44——谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清5—10%NaHCO3调pH至7.0《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第28页!一、实验目的熟练掌握细胞传代培养的操作方法。观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养三、细胞传代培养《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第29页!贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培养，对细胞进行传代扩增。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第30页!胰酶消化的原理：胰酶是一种蛋白酶，通过特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解，致使两者分离。这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为0.25%，PH为7.2-7.4之间。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第31页!三、仪器、材料和试剂超净工作台微量加样器（移液枪）倒置显微镜高压灭菌锅蒸馏水器超低温冰箱二氧化碳培养箱（一）仪器（二）用具、材料细胞培养瓶滴管培养细胞《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第32页!2、传代培养步骤（以下均为无菌操作）从培养箱中取出原代培养细胞并置于超净工作台，弃去培养液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使细胞贴壁面充分浸润，当见到细胞贴壁面的瓶壁出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量培养液终止消化，吹打分散。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第33页!细胞计数：取5ul细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。(计数结果：4.5×106个/ml)。将细胞分装至新鲜的培养液中，使细胞的最终数量调节至1×105～3×105个/mL。置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第34页!观察倒置显微镜的使用方法利用课余时间和下次实验课时间用倒置显微镜进行观察。五、实验报告描绘在倒置显微镜下观察到的现象。六、思考题如何防止传代过程的可能污染？《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第35页!二、实验原理细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第36页!四、实验方法与步骤将细胞悬液充分混匀后取20ul放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置2min。取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多（约10ul），否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第37页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第38页!六、实验报告讨论细胞存活率在研究中应用和意义。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第39页!一、实验目的了解细胞凋亡和坏死的形态特征《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第40页!细胞坏死是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。另外坏死的细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第41页!凋亡坏死《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第42页!四、实验方法与步骤1、细胞收集：取1ml细胞悬液于小离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。2.低渗：向沉淀中加入温浴的0.075mol/LKCl溶液1ml，打成细胞悬液，准确低渗10min。3.预固定：用新鲜固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）预固定一次，室温放置10min，1000rpm离心5min收集沉淀。4.固定：向沉淀中加入新鲜固定液1ml，室温放置10min，1000rpm离心5min，弃上清。5.制片：按照沉淀物的量加入几滴固定液，轻轻打匀后滴片并标记好，室温下空气干燥。6．染色：将干燥的片子在Giemsa染液（母液与3DW体积比为1：6）中染色5min，空气干燥后镜检。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第43页!

实验六细胞器的分离与观察

一、细胞核的分离与观察

二、线粒体的分离与观察

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第44页!二、实验原理细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第45页!

(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第46页!

(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第47页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第48页!中性红-詹纳斯绿染色线粒体分析：詹纳斯绿（JanusgreenB）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染红色。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第49页!植物根尖液泡的中性红染色《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第50页!四、实验方法与步骤

1.细胞核的分离（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第51页!（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶液悬浮，4˚C保存。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第52页!下次实验内容：

（4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥。将干燥的涂片浸入95％乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色20～30min，丙酮分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第53页!2.线粒体的分离(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以10000g(12270rpm)离心10min。沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次。(2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加1～2滴中性红-詹纳斯绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片,染色5min,镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第54页!差速离心

（differentialcentrifugation）主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第55页!沉淀转速x时间内

容

物

A150gx20min完整细胞

B1000gx20min细胞核，细胞碎片C3000gx6min叶绿体

D10000gx20min线粒体、溶酶体、微体

E105000gx120min微粒体

F105000gx20min0.26%脱氧胆酸纳

核糖体

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第56页!如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种大小的颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种不同大小的颗粒在离心管中被分成独立的区带。细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第57页!一、实验目的掌握观察植物细胞内微丝的方法。了解观察动物细胞内微丝的方法。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第58页!细胞骨架微管微丝中等纤维《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第59页!（A）TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作用：一种非离子去垢剂，适当浓度的TritonX-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。（B）M－缓冲液:

M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定，在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂，EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）螯合Ca2＋，并提供Mg2＋离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。（C）磷酸缓冲液作用：清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；（D）戊二醛作用：

良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；（E）考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第60页!四、实验方法与步骤1.取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮作对照，大小1㎝2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液[PBS]（pH6.8）的青霉素瓶中；2.吸去缓冲液，加入1％TritonX-100处理洋葱内表皮20-30min；3.吸去TritonX-100，用M-缓冲液充分清洗3次，每次3min；4.用3%戊二醛固定20min；5.用PBS清洗3次，每次10min；6.0.2％考马斯亮兰R250染色20-30min；7.用蒸馏水清洗1-2次；8.压片，镜检。结果微丝束呈深蓝色《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第61页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第62页!（二）试剂0.17mol/L氯化钠0.17mol/L氯化铵0.17mol/L醋酸铵0.17mol/L硝酸钠0.12mol/L草酸铵0.12mol/L硫酸钠0.32mol/L葡萄糖0.32mol/L甘油0.32mol/L乙醇0.32mol/L丙醇《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第63页!四、实验步骤（一）鸡红细胞悬液取50ml小烧杯一只，加入鸡血1份（1ml）和10（10ml）份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第64页!（三）鸡红细胞的渗透性1.取试管一支加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？为什么？《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第65页!3.分别在下列等渗溶液中进行实验，步骤同2。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第66页!六、实验报告书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表。目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第67页!

实验五

宫颈癌HeLa细胞培养《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第68页!一、细胞培养技术1.体内培养(invivoculture):体内培养技术最大限度地模仿了活体结构的自然生长环境。

最常见的体内培养方式就是移植(transplantation)。

2.体外培养(invitroculture):

按结构成分分为细胞培养(cellculture)

组织培养(tissueculture)

器官培养(organculture)。

3.细胞株(系)与克隆

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第69页!3.细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。4.细胞克隆(cellcloning)：从一个单一母细胞繁殖出来的细胞群体，细胞克隆方法包括：稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法等。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第70页!群体培养（左）和克隆培养（右）《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第71页!动物细胞的培养步骤：

切取拟培养的动物器官或大组织块

洗去血污

剔除多余成分

切成约1mm3大小的组织块将所有组织剪碎

用于组织培养蛋白酶溶液消化

机械方法吹打组织块

离心、培养液悬浮

计数、调节细胞密度

用于分离细胞培养

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第72页!细胞培养所使用的仪器：《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第73页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第74页!

一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第75页!

三、实验内容每一组同学准备两个细胞培养瓶每二组配制一份洗液。清洗二氧化碳培养箱，灭菌。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第76页!五、实验步骤（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。2.使用过的玻璃器皿的清洗（1）立即进入清水，避免干涸难洗；（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液过夜；（4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗3次，倒置烘干；（5）包装（牛皮纸或不透水纸）；（6）高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌；（7）备用。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第77页!（三）洗液的配制常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度（每4个同学配制120ml强洗液：重铬酸钾6.3g、浓硫酸100ml、蒸馏水20ml）成分强酸洗液次强酸洗液重铬酸钾63g3150g120g6000g浓硫酸1000ml50000ml200ml10000ml蒸馏水200ml10000ml1000ml50000ml《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第78页!（四）消毒和灭菌（1）射线消毒灭菌主要使用X、60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。（2）紫外线消毒一般用无臭氧型紫外灯。一般20min，71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min后86%细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能100%灭菌，最多只能达到90%。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第79页!（七）化学消毒法（1）70%（75%）酒精消毒（2）0.1%新洁尔灭消毒（3）来苏儿水消毒（4）0.5%过氧乙酸消毒（5）乳酸蒸汽消毒（6）37%甲醛加高锰酸钾消毒（7）煮沸消毒《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第80页!二、实验原理组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。一、实验目的熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第81页!（二）用具、材料细胞培养瓶微量加样器250ml和125ml试剂瓶、量筒、离心管pH试纸培养细胞《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第82页!四、实验步骤（一）准备(清洗与灭菌）《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第83页!3、通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。4、溶好以后置于超净台中进行0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。5、瓶口封好，-20℃或4℃贮存。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第84页!（四）生长培养基的配制1．双抗：（100000u/ml）160万单位青霉素/瓶+8ml3DW=20万单位/ml1g链霉素+5ml3DW=200000ug/ml各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22um过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第85页!3.饱和NaHCO3的配制每组称取10g的NaHCO3溶于200ml3DW中，过滤除菌后分装于50ml试剂瓶。4℃保存《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第86页!七、思考题：血清在细胞培养中有何作用？为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？配制培养基时调节pH值的目的是什么？六、实验报告写出各自配制试剂的步骤。叙述配制过程中所观察到的现象。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第87页!二、实验原理《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第88页!对于贴壁不太紧的细胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如HeLa、colo205贴壁细胞，则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。常用的消化液为胰蛋白酶。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第89页!胰酶消化的程度是一个关键：消化过度会对细胞活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，甚至造成细胞破碎；消化不足则细胞难于从瓶壁吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。一般消化时间为1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第90页!四、实验步骤

1.RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液44——谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清5—10%NaHCO3调pH至7.0《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第91页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第92页!具体操作：每两个小组共用一个培养瓶配制100ml的生长培养基每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内向细胞培养瓶内接种400ul的HeLa细胞株原液放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第93页!一、实验目的掌握死活细胞的鉴别原理及方法。四、死活细胞的鉴别

实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第94页!三、材料和试剂材料：HeLa细胞株试剂：0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制why？）《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第95页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第96页!五、实验结果每毫升原液细胞数=5格中的细胞总数/5×25（16）×104

×稀释倍数细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第97页!实验五

宫颈癌HeLa细胞株培养五、细胞调亡和坏死的识别(选做)《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第98页!二、实验原理细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第99页!《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第100页!三、材料和试剂材料：人类淋巴细胞株试剂：0.075mol/LKCl溶液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第101页!五、实验结果在显微镜下分别找出凋亡和坏死的细胞，描述形态特征。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第102页!一、实验目的了解细胞器的分离原理掌握差速离心和密度梯度离心技术《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第103页!分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第104页!

(2)分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第105页!Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）

细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。

《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第106页!

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第107页!洋葱内表皮细胞的线粒体分布《细胞生物学实验》课件共120页，您现在浏览的是第108页!三、材料和试剂材料：小鼠的肝脏器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg