上篇遗传物质分子基础

上篇遗传物质分子基础第1页/共71页四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件一、DNA是主要的遗传物质

基因是在染色体上成直线排列的念珠状结构。要了解基因的化学本质是什么，首先要考虑基因所在染色体的化学成分。

上篇

第七章细胞质遗传与植物的雄性不育性第一节遗传物质的分子基础

第2页/共71页染色体的主要成分是DNA和蛋白质，虽然这两种成分都在基因功能上起重要作用，但多数证据证明，基因的特性是由DNA决定，或者说遗传信息贮存于DNA中。（一）DNA是遗传物质的间接证据

1、一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的。但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。

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2、DNA在代谢上较稳定。以放射性同位素示踪，知道一种元素的原子一旦成为DNA分子的组成成分，在细胞的正常生长中，它是稳定存于在DNA中的。而细胞中的其他分子则常常是形成得迅速，分解得也迅速。

3、DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。(4)DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。

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4、用不同波长的紫外线诱发各种生物突变时，其最有效的波长均为2600埃。这与DNA所吸收的紫外线光谱是一致的。这证明基因突变与DNA分子的变异是密切联系的。（二）DNA作为主要遗传物质的直接证据如果DNA的确是遗传物质，那么能否把DNA和蛋白质分开，单独观察DNA的作用呢?下面以微生物为例证明遗传物质确是DNA或RNA。

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1、肺炎双球菌的转化试验肺炎双球菌有两种不同的类型：一种是光滑型（S型），被一层多糖类的荚膜所保护，具有毒性，在培养基上形成光滑的菌落。另一种是粗糙型（R型），没有荚膜和毒性，在培养基上形成粗糙的菌落。在R型和S型内还可以按血清免疫反应的不同，分成许多抗原型，常用RI、RII和SI、SII和SIII等加以区别

早在1928年，格里费斯（Griffith.F.）首先将一种类型的肺双链球菌RII转化为另一种类型SIII，实现了细菌遗传性状的定向转化。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第6页/共71页十六年后，阿委瑞（Avery，O.T.1944）等用生物化学方法证明了这种活性物质是DNA。他们不仅成功地重复了上述的试验，而且将SIII型细菌的DNA提取物与RII型细菌混合在一起，在离体培养的条件下，也成功地使少数RII型细菌定向转化为SIII型细菌。其之所以确认导致转化的物质是DNA，是因为该物质不受蛋白酶、多糖酶和核糖核酸酶的影响，而只能为DNA酶所破坏。

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2、噬菌体的感染试验(Hershey—chase试验)

噬菌体T2约有60％的蛋白质和40％的DNA，蛋白质构成其外壳，而DNA藏在其头部中。当一个噬菌体感染E．coli时，它的尾部吸附在菌体上。细菌被感染后，它不再繁殖，在其体内形成大量韵噬菌体，接着细菌裂解，几十个到几百个跟原来一样的噬菌体就释放出来。那么，噬菌体感染细菌时，进入菌体的是蛋白质，还是DNA呢?四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第8页/共71页

3、烟草花叶病毒的重建试验随着对病毒研究的逐渐深入，发现许多病毒含有RNA和蛋白质，却没有DNA。应用RNA病毒进行病毒重建试验，证明在只有RNA而不具有DNA的病毒中，RNA是遗传物质。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第9页/共71页二核酸的化学结构与自我复制（一）两种核酸及其分布核酸(nucleicacids)是一种高分子化合物，其基本结构单位是核苷酸(nueletide)。每个核苷酸由三部分组成：五碳糖，磷酸和环状含氮碱基(碱基可以是嘌呤或嘧啶)。两种核酸的化学组成成分比较如下(表9—1)。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第10页/共71页四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件表9-1核苷酸的化学组成第11页/共71页

高等动植物体内，绝大部分的DNA在细胞核内的染色体上，它是构成染色体的主要成分，有少量的DNA在细胞质中，它存于叶绿体、线粒体等细胞器内。RNA在细胞核和细胞质中都有，核内更多地集合于核仁上，少量在染色体上。细菌也含有DNA和RNA。多数噬菌体只有DNA；多数植物病毒只有RNA；动物病毒有些含有RNA，有些含有DNA。

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(二）DNA的分子结构DNA分子是脱氧核苷酸的多聚体。脱氧核苷酸是由碱基、脱氧核糖及磷酸连接起来构成的。因为构成DNA的碱基有四种，所以脱氧核苷酸也有四种，即脱氧腺嘌呤核苷酸，脱氧鸟嘌呤核苷酸，脱氧胸腺嘧啶核苷酸，脱氧胞嘧啶核苷酸(图9-3)

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第13页/共71页四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件图9-3两种核糖和五种常见的碱基第14页/共71页对一定物种的DNA分子来说，其碱基顺序是一定的，并且通常保持不变，这样才能保持该物种遗传特性的稳定。只有在特殊的条件下，改变其碱基顺序或位置或以类似碱基代替某一碱基时，才出现遗传的变异（突变）。至于RNA的结构，就其化学组成上看，也是由四种核苷酸组成的多聚体。它与DNA不同：①U代替了T；②核糖代替了脱氧核糖；③绝大多数RNA以单链形式存在，但可折叠起来形成若干双链区域，在这些区域内，凡互补的碱基可以形成氢键。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第15页/共71页图9-4DNA分子的双螺旋结构模式A．腺嘌呤T．胸腺嘧啶G．鸟嘌呤、C．胞嘧啶=为氢键S脱氧核糖P磷酸根

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第16页/共71页（三）DNA及RNA在活体内的自我复制DNA既然是主要的遗传物质，它必然具备自我复制的能力。瓦特森认为DNA分子的复制，首先是从它的一端沿氢键逐渐断开，因氢键较弱，在常温下不需要酶即可断开。当双螺旋的一端已为两条单链而另一端仍保持双链状态时，以分开了的每条单链为模板，从细胞核内吸取与自己碱基互补的游离核苷酸(A吸T，c吸G)，进行氢键的结合，在复杂的酶系统(如DNA聚合酶I、II、III，连接酶等)作用下，逐步连接起来，各自形成一条新的互补链，与原来的模板单链互相盘旋在一起，恢复了DNA的双分子链结构。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第17页/共71页

这样随着DNA双分子螺旋的完全拆开，就逐渐形成了2个新的DNA分子，与原来的完全一样。DNA的这种复制方式称为半保留复制，因为复制所形成的新DNA分子，保留了原来亲本DNA双链分子的一条单链。DNA在活体内的半保留复制性质，已为1958年以来的大量试验所证实。DNA的这种复制方式对保持生物遗传的稳定是非常重要的。

RNA在传递DNA遗传信息和控制蛋白质的生物合成中起着重要作用

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。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件图9-5冈崎等关于DNA复制的假说

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三遗传信息的传递和表达

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件（一）DNA与遗传密码生物的大部分遗传性状都是直接或间接地通过蛋白质表现出来的。DNA是如何决定蛋白质的合成?DNA上的遗传信息与蛋白质之间是一种什么对应关系?这就涉及到遗传密码的问题。自然界中蛋白质种类繁多，单细胞大肠杆菌的蛋白质就有2000多种，人的蛋白质有10万多种。蛋白质虽然种类繁多，但都以同样的20种氨基酸为单元前后连结而成。第20页/共71页

生物体中常见的氨基酸有20种，不同的氨基酸有不同的侧链，是各种氨基酸相异的部分。当一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失去一分子水后，由肽键将两个氨基酸连接起来，形成三肽、四肽。由多个氨基酸连结而成的肽链称为多肽链。多肽链是蛋白质的一级结构。除了一些抗菌素和简单的激素是长短不同任意伸展的肽链外，较复杂的蛋白质是多肽链反复折叠形成的立体结构。具有一定立体结构的蛋白质分子才有活性。特定的立体结构决定于多肽链上氨基酸成分及其排列顺序。

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DNA链上的脱氧核苷酸序列决定了它所控制的多肽链上的氨基酸序列。已知DNA的四种脱氧核苷酸的差别在于四种碱基的不同，因而实质上是碱基的序列决定氨基酸的序列。碱基只有四种，而氨基酸有20种，那么四种碱基如何决定氨基酸的种类和排列顺序呢?

大量试验发现每三个碱基决定一个氨基酸，也就是3个碱基组成一个三联体密码，可翻译成一种氨基酸。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第22页/共71页

但由于DNA不能直接作为合成蛋白质的模板，必须以DNA双链中的一条链为模板，通过互补的方式将遗传信息转录到信使RNA(mRNA)上，然后在核糖体的作用下，按mRNA上的密码顺序合成相应的多肽链。1966—1967年完成的三联体密码表(表9-2)中的密码子是经互补转录于mRNA上的密码顺序。从表9-2中可以看出，三联体密码子共64个，而氨基酸只有20种，这就存在简并现象，即一个特定的氨基酸由一个以上三联体密码所决定。

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在简并现象中，当三联体密码的第一个，第二个碱基决定之后，有时不管第三个碱基是什么，都决定同一个氨基酸。例如，脯氨酸(pro)为CCU，CCC，CCA，CCG四个三联体密码。因此，第一个、第二个碱基比第三个碱基更为重要。简并现象对生物遗传的稳定性具有重要意义，同义的密码子越多，生物遗传的稳定性愈大。因为一旦DNA分子上的碱基发生突变时，突变后所形成的三联体密码翻译成同样的氨基酸，因而在多肽链上就不会表现任何变异。遗传密码表中，UAA、UAG、UGA为蛋白质合成的终止信号。AUG兼有合成起始的信号。

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（二）DNA与蛋白质的合成

DNA的碱基序列决定氨基酸序列的过程即是蛋白质的合成过程，实际上包括遗传密码的转录和翻译两个步骤。1转录(transcription)

转录就是以DNA双链之一的遗传密码为模板，根据互补方式合成RNA，把DNA上所带的遗传信息，传给RNA的过程。转录后形成的RNA进入细胞质中，控制蛋白质的合成，因为这种RNA传达DNA上的遗传信息，所以称为信息RNA或mRNA。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第25页/共71页

2翻译(translation)

翻译是指携带着转录遗传信息的mRNA附着在核糖体(ribosome)上，把由转移核糖体(tRNA)运转来的各种氨基酸，按照mRNA的密码顺序，相互连接起来成为多肽链，并进一步折叠起来成为立体蛋白质分子。所以蛋白质的翻译合成是mRNA、tRNA、rRNA和核糖体协同作用的结果。

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（1）tRNA(转运RNA)如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力，因此，必须用一种特殊的RNA——转运RNA把氨基酸搬运到核糖体上。每一个tRNA分子可以认出一个特定的氨基酸，与这个氨基酸形成共价键，把它运到核糖体上，在那儿找到自己的位置。这样tRNA就能按照mRNA上的密码子，把各种氨基酸排列起来。每种氨基酸各与一种或一种以上的tRNA相结合。

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（2）rRNA（核糖体RNA）它是核糖体的主要组成成分，一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体。如果把rRNA从核糖体上拿掉，就会发生塌陷。rRNA是单链结构，它含有不等量的A与u，以及G与c，但有广泛的双链区域，成为发夹式螺旋。rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全了解，但16SrRNA的3’端有一段核苷酸顺序是与mRNA的前导顺序互补的，这有助于mRNA与核糖的结合，也说明在合成蛋白质分子的起始阶段，rRNA起着重要作用。

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（3）核糖体核糖体是合成蛋白质的中心，是rRNA与核糖体蛋白结合起来的小颗粒，直径为14～30nm。在细菌的细胞内，核糖体在细胞质内；而在高等生物的细胞内，它则附着在细胞的内质网上。每个核糖体包含2个不同的亚基，由Mg++结合起来，呈不倒翁形。

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（4）多肽链在核糖体上的合成经转录合成的mRNA进入到细胞质后，附着在核糖体的小亚基上，就启动了多肽链的合成。作为蛋白质结构单元的氨基酸，必须先经过活化，即先在氨基酰-tRNA合成酶作用下，与相应的tRNA结合形成氨基酰-tRNA，才能缩合成肽链。运送各种氨基酸的氨基酰-tRNA带着自己所运送的氨基酸，用它们的反密码子依次分别与附着在核糖体上的mRNA的互补密码子相结合，其次卸下它们运送的氨基酸，在转肽酶的催化下，在核糖体上形成多肽键，随着mRNA逐渐移出核糖体，一条多肽链就逐渐被释放出来。

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可见，核糖体在这里既起装配员的作用，将氨基酸装配成多肽，又起了翻译协助员的作用，因为mRNA如果不附着于核糖体上，就不能执行翻译的使命。在核糖体上合成的多肽链，经过链的卷曲或折叠，成为具有立体结构的、有生物活性的蛋白质，它们或者成为结构蛋白，作为细胞的组成成分；或者成为功能蛋白，如血红蛋白等；或者成为控制细胞各种化学反应的酶。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第31页/共71页

（三）中心法则及其发展前面叙述遗传信息从DNA到DNA的复制过程，以及蛋白质合成过程(遗传信息从DNA—mRNA一蛋白质的转录和翻译过程)，就是分子生物学的中心法则(centraldogma)(图9—7a)，a)。但以后随着研究的不断深入，中心法则有了新的发展。

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图9-7中心法则9（a）及其发展（b）

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第33页/共71页第二节基因概念的发展四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件基因是遗传变异的基本单位，基因的结构和功能则是贯穿在整个遗传学研究中的主线，遗传学发展史本身就清楚地说明了一点。一经典遗传学关于基因的概念孟德尔最初将控制生物性状的因子称为遗传因子（inheritedfactor）。1909年，丹麦遗传学家约翰逊提出了基因（gene）这个名词，取代了孟德尔的遗传因子，一直沿用至今。以后摩尔根及其同事们以果蝇、玉米为材料，经过大量研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学。

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经典遗传学关于基因的概念有如下几个要点：1.基因具有染色体的主要特性：自我复制与相对稳定性，在有丝分裂和减数分裂中有规律地进行分配。2.基因在染色体上占有一定位置（位点），并且上交换的最小单位，即在重组时不能再分隔。3.基因以整体进行突变，是突变的最小单位。4.基因是一个功能单位，它控制着正在发育有机体的某一个或某些性状。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第35页/共71页

由于基因的交换、突变都涉及基因的结构，因此突变单位和重组单位也统称为结构单位，所以，经典遗传学认为基因既是一个结构单位又是一个功能单位。二分子遗传学关于基因的概念但基因究竞是由什么物质构成的？基因的本质是什么？经典遗传学无法回答这个问题。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第36页/共71页

另一方面，在精密的微生物遗传分析中发现，基因并不是不可分割的最小遗传单位，而是远为复杂得多的遗传和变异的单位。例如，在一个基因的区域内，仍然可以划分出若干个起作用的小单位。按照分子遗传学的观点，突变，重组和功能这三个单位分别是：①突变子（muton）：是指性状发生突变时，产生突变的最小单位，即改变后可以产生突变型表型的最小单位。最小的突变子可以是一个核苷酸对。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第37页/共71页②重组子（recon）：是指发生性状重组时，产生重组的最小单位，或者说不能由重组分开的基本单位。可小到只包含一个核苷酸对。③顺反子（cistron）：是与经典基因概念的功能单位相当的概念，或者说就是一个基因。顺反子是与一条多肽链的合成相对应的一段DNA序列，是一个完整的不可分割的最小功能单位，它的平均大小为500～1500bp。概言之，基因是一段有功能的DNA序列，是一个遗传功能单位，其内部存在有许多的重组子和突变子。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第38页/共71页三现代基因概念的新发展——基因的多样性四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件但20世纪70年代后，发现:所谓重叠基因、重复基因、间隔基因和跳跃基因的存在，使基因的概念又有了新的发展。1.重叠基因（overlappinggene）是指不同基因共用相同的碱基密码，即同一段DNA编码顺序，由于阅读的框架不同或终止的早晚不同，同时编码两个以上的基因。第39页/共71页2.重复基因（repetitivegene）生物的基因组十分复杂，往往是由各种单一顺序和重复顺序组成。所谓重复基因是指基因组内有多份相同编码的核苷酸序列。3.间隔基因（splittinggene）在真核生物中，基因是间隔的，其结构包括可转录可翻译的外显子（extron），也包括可转录但不翻译的内含子（intron），二者镶嵌排列。4.跳跃基因（jumpinggene）是指在染色体上可以转移位置的基因，也称为转座因子（transposableelement）。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第40页/共71页5.假基因（pseudogene）一个完整的基因有一个启动子、内含子、外显子和终止子等等。假基因是指没有启动子、内含子、外显子的C-DNA，是在逆转录酶作用下以mRNA为模板形成的DNA。假基因是与功能性基因密切相关的DNA序列，它的产生可能是由于相应的正常基因缺失、插入和无义突变失去阅读框而不能编码蛋白质产物。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第41页/共71页

第三节基因的作用与性状的表达

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在生物的个体发育过程中，基因一旦处于活化状态，就将它携带的遗传密码通过mRNA的转录和翻译，形成特异的蛋白质。由于大部分遗传性状都是直接或间接通过蛋白质表现出来的，因此深入了解基因在这方面的作用，对于了解遗传的本质具有重要的意义。基因对于遗传性状表达的作用可以分为直接作用和间接作用两种。第42页/共71页一直接作用在生物的个体发育中，处于活跃状态的基因将它携带的遗传密码，通过mRNA的转录和翻译，如果最后产品是结构蛋白或功能蛋白，那么基因的变异可直接影响到蛋白质的特性，从而表现出不同的遗传性状，这就是直接作用。人类镰刀红细胞贫血症的出现就是典型的例证。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第43页/共71页二间接作用

大多数情况下，基因是通过控制酶的合成，间接地影响生物性状的表达。例如在孟德尔的豌豆杂交试验中，高茎豌豆（TT）×矮茎豌豆（tt），其F1表现为高茎豌豆（Tt），这是因为高茎基因T对矮茎基因t是显性。为什么T表现高茎，而t表现为矮茎呢？研究表明，这主要是由于高茎品种中含有一种能促进茎部节间细胞伸长的物质——赤霉素，而矮茎品种中则没有这种物质。赤霉素的产生需要酶的催化。高茎豌豆中的T基因具有特定的核苷酸序列，可以转录翻译成正常的促进赤霉素合成的酶，使之产生了赤霉素，从而使细胞得以正常伸长，于是表现为高茎；矮茎豌豆的t具有与T不同的核苷酸序列，不能转录翻译成促进赤霉素形成的酶，因而不能产生赤霉素，细胞便不能正常伸长，于是表现为矮茎。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第44页/共71页第四节遗传工程简介

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件一、遗传工程的概念遗传工程是20世纪70年代才开始发展起来的一门新技术，它是在分子遗传学理论基础上，综合采用了分子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。广义的遗传工程包括基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等等，狭义的遗传工程是指基因工程。本节将就狭义的遗传工程——基因工程作简要介绍。

第45页/共71页基因工程（geneengineering），又称重组DNA技术（recombinantDNAtechnology），是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。它可以将某种生物的基因或基因组转移到另产种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状成为新的类型。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第46页/共71页

基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，利用无性的操作技术使基因在微生物、植物、动物等各大系统间进行交流，以便迅速地和定向地获取人类所需要的新的生命类型，这样就使遗传学与育种学发展到一个新的阶段。

从理论上看，基因工程是研究分子遗传学基本理论的一个重要方面，它既为细胞分化、生长发育、肿瘤发生等高等生物的基础研究提供有效的实验手段，又为解决基因和基因组的精细结构、功能、控制机理等问题提供必要的分析方法；从实践上看，基因工程的研究，将为解决农业、工业、医学等部门所面临的许多重大问题开辟了新的途径。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第47页/共71页二、基因工程的操作过程四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件基因工程技术包括三个基本要素：载体、工具酶和表达系统（原核或真核宿主细胞），其技术路线大致包括以下几个操作程序：①准备材料。包括载体和工具酶的准备以及目的基因的分离和制备；②构建重组DNA分子。把目的基因与载体结合成重组DNA分子，即进行基因的体外重构；③外源DNA导入受体细胞。把含外源DNA片段的重组DNA分子引入宿主受体细胞，建立分子无性繁殖系；④筛选重组DNA分子、鉴定目的基因表达。从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。第48页/共71页(一)准备材料1.工具酶工具酶指在重组DNA技术中用于切割、连接、修饰DNA或RNA的一系列酶。它们是基因工程中的基本工具，其中最重要的是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，其它常用工具酶包括DNA多聚酶、反转录酶、核酸酶H、碱性磷酸酶等。下面扼要介绍限制性核酸内切酶。

DNA是巨大分子，进行DNA操作时，必须加以切割，这就需要限制性核酸内切酶把DNA链在特定部位切断。1970年开始分离得到的限制性核酸内切酶，是开拓基因操作新领域的关键。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第49页/共71页

限制性核酸内切酶能识别DNA的特定碱基序列，并把DNA链在特定位点切断。

已知的限制性内切酶已超过350种，根据其来自的生物名称进行命名的，一般取来源生物的属名的第一个字母（大写）、种名的前两个字母（小写），再加上菌株代号的第一个字母组合而成。如果同一物种中具有不同特异性的限制性内切酶，则分别用大写罗马数字来表示。如HindⅢ是从嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中提取的第三种限制性内切酶。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第50页/共71页2.载体载体（vector）是指能将目的基因的DNA片段带入宿主细胞并能进行扩增的一类DNA分子。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。作为运载工具，载体必须具备三个条件：①在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存；②有多种限制性内切酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，且酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因（genemarker）的能力，并能嵌入外源DNA片段；③具有可作为重组DNA分子选择的遗传标志。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第51页/共71页

目前作为转入原核细胞宿主的载体主要有两大类：λ-噬菌体和细菌质粒。而作为转入真核细胞宿主的载体，在动物方面主要有类人猿病毒SV40（SimianVirus40），在植物方面主要有农杆菌的Ti质粒。3.目的基因的分离和制备工具酶和载体备好了，下一步就是要获取目的基因。目的基因（target）是指准备导入受体细胞内的、以研究或应用为目的所需要的外源基因。获得目的基因是进行DNA重组最重要的一步，也是十分困难的一步。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第52页/共71页

获得目的基因的方法很多，但目前主要通过5条途径获取：（1）从生物基因组群体中分离目的基因。一般用限制性核酸内切酶把一个基因组DNA分成很多片段。原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，直接用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。对于基因组较大的真核生物，则可先制作基因文库，然后钓取所需要的带有目的基因的DNA片段而获得目的基因。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第53页/共71页

（2）人工合成目的基因DNA片段。人工合成目的基因DNA片段有化学合成法和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。（3）PCR技术合成DNA。聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种简单的酶促反应，它以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第54页/共71页

现代分子生物学发展到今天，人类基因组全序列已经测出，并且越来越多的模式生物的基因组全序列正在被测出，PCR法已经成为分离目的基因的主要手段。(二)构建重组DNA分子外源基因（DNA片段）很难直接透过受体细胞的细胞膜进入受体细胞，即使进入，也会受到细胞内限制性酶的作用而分解。要将外源DNA片段导入受体细胞，选择适当的载体是关键步骤之一。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第55页/共71页

含有目的基因的DNA片段和载体DNA的连接技术即DNA重组技术，其核心步骤是DNA片段之间的体外连接，其本质是涉及限制酶、连接酶等工具酶的酶促反应过程。重组DNA即将载体DNA与引入的DNA连接，把目的基因连接到载体上去。根据DNA末端性质不同，形成重组体DNA分子的方法也有所不同。

四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第56页/共71页1.黏性末端的连接。用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同黏性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补，用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。2、平齐末端的连接。可先生成黏性末端，在带平头末端的DNA片段的3′-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DNA连接酶连接。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第57页/共71页(三)外源DNA导入受体细胞重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞，才能进行大量地复制，扩增和表达。受体细胞有许多种，原核细胞、低等真核细胞生物的细胞如酵母、植物细胞、哺乳动物细胞等都可以作为受体细胞。例如胰岛素基因工程生产就是将外源DNA导入原核细胞大肠杆菌中进行表达实现的。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第58页/共71页

通过限制性内切酶或逆转录技术可以获取包含某生物体所有基因的DNA片段集，如果把每一个片段与载体连接并分别导入受体细胞，这样就能得到所有包含该生物体全套基因的库，称之为基因文库(genelibrary)，对于其中中只含有一个外源DNA片段的菌群，称之为分子无性繁殖系或克隆(clone)。通过基因文库的构建，就可以根据需要随时从文库中选择目的基因。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第59页/共71页(四)筛选重组DNA分子、鉴定目的基因表达基因工程最重要的目标是能使目的基因在宿主细胞中表达并产生人们所需的蛋白质，在大肠杆菌中游离于细菌染色体外的质粒基因也可获得表达，但在最高等生物中重组DNA分子引入受体细胞后，需要整合到受体的基因组中，才可能表现应有的生物活性，在受体细胞遗传系统的调节控制下，才能正确地转录与翻译出有功能的多肽。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第60页/共71页三、农作物转基因育种简介基因工程应用于农业生产是农业生物技术领域中研究和开发最为活跃的部分。应用重组DNA技术将目的基因导入动、植物体内，对家畜、家禽和农作物等进行品种改良已取得了可喜的进展，尤其在农作物转基因育种方面所取得的成就更为引人注目。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第61页/共71页自从1983年首次获得转基因植物——转基因烟草以来，基因工程在农业方面的研究与应用进入了蓬勃发展阶段。目前，植物基因工程已经在多方面有了深入的发展，包括抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品质改良等。此外，在植物发育调控、成熟期的调控方面也有了长足发展。基因工程在农业生产上的应用深刻影响到农业的生产方式和效益，在解决人类所面临的环境恶、资源匮乏等方面初步显示出巨大的作用。由于转基因农作物品种推广和应用的时间还不长，对其可能带来的负面作用特别是对人体健康和生态环境的影响进行正确评价还需要时间。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第62页/共71页(一)利用基因工程培育抗除草剂作物化学除草剂在现代农业中起着十分重要的作用。20世纪80年代中期开始除草剂抗菌素基因的转移研究与抗性品种的开发。目前世界上采用的除草剂主要分为两大类，一类是通过破坏氨基酸合成途径来杀死杂草。另一类是通过破坏植物光合作用中电子传递链的蛋白来杀死杂草。现已获得的抗除草剂转基因作物有大豆、棉花、玉米、水稻、甜菜等20多种，抗除草剂的转基因作物占总的转基因作物的70%以上。四川省高等教育人才培养质量和教学改革项目精品课程课件第63页