大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3（1.河北北方学院，河北张家口，075131；2.中国人民解放军军需大学，吉林长春；130062；3.军事兽医研究所，吉林长春；130062）摘要：目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词：大肠杆菌多重耐药外输泵acrAmarA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（effluxpump）的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发现外输泵最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星，对照品，中国兽医药品监察所出品。染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。载体与质粒：克隆载体为pGEM－T，Promega公司产品。酶与试剂：T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂；DNA片段凝胶回收试剂盒（AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0），TaKaRa公司产品；国家自然基金资助项目，No30270999作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者E-mail：zhw5148@分子量标准参照物：DNAMarkerDL2,000、λ－HindⅢdigestDNAMarker，均为TaKaRa公司产品。引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5´－ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGCCT－3´；下游引物（PACR－R）5´－TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG－3´，marA的上游引物（PMAR－F）序列为5´－ATGACGATGTCCAGACGCAATAC－3´，下游引物（PMAR－R）5´－CTAGCTGTTGTAATGATTTAATGG－3´。上海博亚生物技术有限公司合成。仪器：生物显微镜，OLYMPUS产品；PCR扩增仪，TC－25/H型，杭州DAHETHERMO－MAGNETICSCO.LTD产品；电泳仪，DYY－6B型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器，HZQ－C，哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL－16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。1.2.方法1.2.1菌株鉴定对购进的菌株作生化和形态鉴定，以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养，再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基质试验、M.R试验、V—P试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴定确认为ATCC25922的菌株作后续实验之用。1.2.2MIC测定按照NCCLS（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards）规定的方法配制包括诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药的标准溶液；用2倍连续稀释法配制各种含抗菌药的营养肉汤培养基，抗菌药的首选浓度范围为0.125～4.0μg/ml培养基（据细菌生长情况再作升或降的调整）。在1ml培养基中接种100μl菌液（约为105CFU）；37oC培养24h，确定MIC。1.2.3诱导分别在三种含1/2×MIC诱导剂的麦康凯培养基接种适量培养物（约105CFU），37oC培养24h，挑选生长良好的菌落，接种于1×MIC诱导剂的培养基37oC培养24h，以此类推，逐渐提高培养基中诱导剂的浓度直到诱导前MIC的128倍（据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度可在1～2倍于原浓度的范围适当调整，也可当细菌生长不良时在同一个浓度重复传代培养）。1.2.4上一步最后获得的诱导剂浓度达到128×MIC的耐药株，作4次无诱导剂传代培养后，再分别测定三个诱导株对所有受试抗菌药的MIC，以确定三个诱导株的多重耐药谱。1.2.5受试菌株acrA、marA基因序列的检测 据上一步耐药谱检测结果，氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的耐药谱相近，而四环素诱导株的耐药谱与之差异较大，故选择四环素诱导株（名为SEMR）、环丙沙星诱导株（名为SEICI）和质控株（ATCC25922）作acrA、marA基因序列的检测。目的基因（acrA、marA.1DNA提取：按卢圣栋等[4].2acrA、marA基因的PCR扩增：以大肠杆菌染色体DNA为模板，用引物PACR－F和PACR－R扩增acrA（全长1194bp），用PMAR－F和PMAR－R扩增marA（全长390bp）。取5µlPCR产物在0.7%.3PCR产物的回收：用DNA片段凝胶回收试剂盒回收acrA和marAacrA、marA.1目的基因片段与载体的连接：将回收的PCR产物连接到pGEM－T载体上。反应体系为：2×RapidLigationBuffer，5µl；PCR产物（2ng/µl），3µl；pGEM－Tvector（50ng/µl），1µl；T4DNALigase，1µl。.2感受态菌的制备：CaCl2法制备DH5α感受态细胞[.3重组质粒的转化：参照《分子克隆指南》[.4阳性克隆的筛选：利用α互补法（蓝/白菌落筛选法）进行阳性克隆的初步筛选[.3.1提取质粒：碱裂解法[5]提取质粒，作0.7％琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察并拍照。.2重组质粒的酶切鉴定：用NcoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T质粒。将经过电泳筛选出的疑似阳性克隆质粒进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切反应，同时做阴性克隆质粒的酶切对照。酶切反应体系为：克隆质粒，5µl；10×HBuffer，1µl；0.1%BSA，2µl；NcoⅠ，1µl；NotⅠ1µl；ddH2O，10µl。37℃恒温水浴2~4h。.3.3重组质粒的PCR扩增鉴定：利用PCR反应，对经过上述鉴定的疑似阳性质粒再作PCR扩增鉴定。用引物PACR－F和PACR－R扩增鉴定acrA－pGEM－T质粒；用PMAR－F和PMAR－R扩增鉴定marA－pGEM－T质粒。取5µlPCR扩增产物在0.7%对经上述鉴定后均符合要求的阳性克隆质粒进行序列测定（上海博亚生物技术有限公司完成），用DNAsis软件分析测序结果。2结果2.1受试药物的MIC包括三种诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药对于质控株的MIC见表1。2.2诱导株的耐药性变化四环素、环丙沙星和氯霉素三个诱导株的MIC变化详见表2。从表中可见，在四环素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外，青霉素钾、头孢噻肟、四环素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢西丁的MIC提高幅度都有达到或超过4倍（经统计处理，MIC变化值≥4×MIC为具有显著性意义）；在环丙沙星诱导株，只有头孢噻肟MIC提高倍数达到或超过了4，而其它受试抗菌药的MIC变化都没有显著性意义；氯霉素诱导株与环丙沙星诱导株相似，只有头孢噻肟的MIC提高具有显著性意义，而其他药物没有显著意义。2.3acrA、marA基因检测结果2.3.1SEMR、SEICI和ATCC25922基因组DNA的提取结果从ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色体DNA作0.7%的琼脂糖凝胶电泳，观察到一条特异带，大于23kb。见图1。2.3.2SEMR、SEICI、ATCC25922acrA、marA基因的PCR扩增结果acrA、marA的PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarkerDL2,000为对照，结果在约1194bp和390bp处分别出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。见图2、图3。表1受试药物的MIC（ug/ml）Table1MICofantibacterialagents（ug/ml）抗菌药MIC抗菌药MIC抗菌药MICantibacterialagentsantibacterialagentsantibacterialagents青霉素钾BenzylpenicillinK64氧氟沙星Ofloxacin0.5甲砜霉素Clinfenicol16头孢噻肟Antibacterial0.25诺氟沙星Norfloxacin0.25阿米卡星Amikacin32四环素Tetracycline4头孢西丁Cefoxitin0.5环丙沙星Ciprofloxacin0.25土霉素Oxytetracycline8链霉素Streptomycin64妥布霉素Tobramycin8氯霉素Chloramphenicol16小诺霉素Micronomicin1利福平Rifampicin32表2诱导菌株的MIC变化Table2ChangeforMICofinducedstrains受试药物antibacterialagents诱导后MIC提高倍数IncreasingpowerofMICafterinduction四环素诱导株环丙沙星诱导株氯霉素诱导株strainsofTetracyclinestrainsofCiprofloxacintrainsofChloramphenicol青霉素钾BenzylpenicillinK802头孢噻肟Antibacterial25688四环素Tetracycline12820土霉素Oxytetracycline1620氯霉素Chloramphenicol420利副平Rifampicin400甲砜霉素Clinfenicol1600环丙沙星Ciprofloxacin400氧氟沙星Ofloxacin822诺氟沙星Norfloxacin822头孢西丁Cefoxitin410链霉素Streptomycin100小诺霉素Micronomicin122妥布霉素Tobramycin000阿米卡星Amikacin0012.3.1阳性克隆的筛选结果转化平板经过16~20h37℃的倒置培养，出现了稀疏的蓝色和白色的克隆菌落。其中蓝色菌落为阴性克隆，为T2.3.2分别利用扩增引物，PCR鉴定各克隆质粒，结果可见到特异目的带，见图4。2.3.3将经过PCR鉴定筛选出的疑似阳性克隆质粒acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果在约2974bp、1220bp和416bp处分别出现特异的载体、acrA和marA的目的片段。见图5、图6。2.3.4a由DNAsis软件分析测序结果表明，acrA和marA克隆质粒序列，在ATCC25922、SEMR和SEICI都一致，与GenBank中发表序列同源性为100%，acrA和marA基因在四环素诱导株和环丙沙星诱导株均没有发生突变。3讨论普遍的观点认为，抗菌药物的使用是病原菌产生耐药性的关键所在。由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，给细菌的生存环境造成了选择性压力，这种环境压力因素可以通过多种机制导致病原菌对抗菌药物产生耐药性。药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，药物外输泵系统相关mRNA的表达增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加，使细胞内的药物被泵出，从而使细菌耐药。由于外输泵种类较多，作用底物广泛（包括抗菌药、染料、消毒剂、洗涤剂、有机溶剂、亲脂阳离子、脂类、抗微生物多肽类、化学药物等），所以主动外输系统介导的耐药性呈现多重耐药的特点[6～9]。本实验依据细菌耐药性的原因和机理，人为造成一种抗菌药的选择性压力环境，对大肠杆菌质控株进行体外选择性诱导培养，以期产生耐药性。从诱导前后多种抗菌药MIC的变化结果看，四环素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外，青霉素钾等11种抗菌药的MIC都有明显提高，即表现了不同程度的耐药。从耐药谱看，产生耐药的抗菌药分属于几类在结构和作用机理上各不相同的类别，说明四环素诱导株产生了多重耐药。大肠杆菌是发现外输泵最多的一种细菌，在埃希氏大肠杆菌上发现了约30种外输泵，但一般认为AcrAB－TolC是最主要的外输泵[10]。有人报导大肠杆菌外输泵AcrAB的作用底物包括吖啶橙、结晶紫、溴乙啶、镰孢菌酸、四环素、氯霉素、新霉素、红霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氨比西林、氟喹诺酮类、β－内酰胺类、利福平、吐温X－100等多种制剂[9、11]。本实验的耐药谱在受试的抗菌药范围内耐药谱与AcrAB的作用底物大体一致。这个结果提示，四环素诱导大肠杆菌株多重耐药性的产生可能是由于激活了它的包括AcrAB在内的主动外排系统。本实验中另外的氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株只对头孢噻肟一种抗菌药产生了耐药。导致这种结果的原因我们还不能确切定论，参考有关资料推测，假定AcrAB激活是多重耐药产生的直接机制，则acrAB又受到mar等的调控，有实验表明环丙沙星不是操纵子mar的诱导因子，但是操纵子Mar的诱导能力对药物产生低水平的耐药性；Hachler认为，大肠杆菌操纵子突变体能被选择，选择时用环丙沙星选择的频率大大低于能被接受的诱导物如四环素等的频率[12]。由此可以认为抗菌药的选择性压力与主动外输系统的交互作用在一定程度活范围内是有特异性的。四环素能较容易地诱导大肠杆菌产生多重耐药这一结果还提示，四环素类抗菌药的使用要慎重或不提倡使用，特别是对于肠杆菌疾病的治疗。由此还可以联想到，在目前人们对付病原菌耐药性尚没有确实有效的办法的情况下，倒可以如世界卫生大会（WorldHealthAssembly,WHA）[13]敦促的那样，在消除对病原菌人为的选择性环境压力，减少对耐药性的诱导方面多下些功夫。这不仅在现在，即使在将来人们逐渐找到了一些对付病原菌耐药性的办法，仍然不失为具有战略意义的对策。从实验结果还发现，产生了耐药的抗菌药其MIC的提高幅度不尽一致。对此种现象产生的原因，推测是由于不止一种外输泵的激活，或是可能还有其他的耐药机制的作用。因为细菌的耐药有着多种而复杂的机制[14]，一种或几种机制可能同时作用于某一种/一类抗菌药，多种耐药机制错综的作用于不同的各类药物，可能是导致本实验中这种耐药的不整齐性的主要原因。特别是四环素的MIC提高幅度达128倍，极有可能存在另外的四环素耐药机制，比如四环素排出系统（Tet）的参与。本实验对多重耐药株、单药耐药株和质控株对编码AcrAB－TolC外输泵组分之一AcrA[2]的acrA基因和其调控基因marA[15]作了完整的克隆和侧序，二者的测序结果在上述的3个菌株都是一致的，与文献报道结果的同源性均为100%，说明SEMR和SEICI的acrA和marA基因都没有碱基的改变，四环素、环丙沙星的诱导培养引起菌株的药敏变化是在acrA和marA基因没有突变的情况下发生的，即SEMR菌株多重耐药性的产生是由于除acrA和marA突变以外的其他原因。参考文献：[1]SulavikMC,HouseweartC,CramerC.AntibioticsusceptibilityprofilesofEscherichiacolistrainslackingmultidrugeffluxpumpgenes..AntimicrobAgentsChemother,2001,45:1126.[2]FralickJA.EvidencethatTolCisrequiredforfunctioningoftheMar/AcrABeffluxpumpofEscherichiacoli.JBacteriol,1996,178:5803.[3]马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册.北京:科学出版社,2001,142[4]卢圣栋,等.现代分子生物学实验技术.中国协和医科大学出版社.2版,北京,1999.9.[5]萨姆布鲁克DW拉塞尔（著）,黄培堂,等（译）.分子克隆实验指南.科学出版社,北京,2002.8[6]PaoSS,PaulsenIT,SalerMH.Majorfacilitatorsuperfamily.MicrobiolMo[7]VanVeenHW,KoningsW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图1SEMR、SEICI、ATCC25922菌株基因组DNA提取物的琼脂糖电泳Figure图1SEMR、SEICI、ATCC25922菌株基因组DNA提取物的琼脂糖电泳Figure1gelosegelelectrophoresiswithGenomeDNAofATCC25922,SEMRandSEICI.1:λ－HindⅢdigestDNAMarker;2:E.ColiATCC25922;3:SEMR;4:SEICI图4克隆质粒的PCR鉴定Figure4TheidentificationofcloningplasmidmonitoringwithPCR1,2,3:marAofATCC25922,SEMR,SEICI;M:DL2,000DNAMarker;4,5,6:acrAofATCC25922,SEMR,SEICI.图2acrA基因的PCR扩增结果Figure2TheamplificationofacrAgenewithPCR1:ATCC25922;2:SEMR;3:SEICI;M:DL2,000DNAMarker1:acrA;2:DL2,000DNAMarker图3图3marA基因的PCR扩增结果Figure3TheamplificationofacrAgenewithPCR1:ATCC25922;2:SEMR;3:SEICI;M:DL2,000DNAMarker图5克隆质粒的酶切鉴定Figure5图5克隆质粒的酶切鉴定Figure5TheidentificationofCloningplasmidmonitoringwithrestrictionenzymedigestion1,2,3:acrA－pGEM-TofTCC25922,SEMR,SEICI4:λ－HindⅢdigestDNAMarker;图6克隆质粒的酶切鉴定Figure6TheidentificationofCloningplasmidmonitoringwithrestrictionenzymedigestion1:λ－HindⅢMarker;2,3,4:marA－pGEM-TofATCC25922,SEMR,SEICI;5:DL2,000DNAMarker

附录资料：不需要的可以自行删除锅炉基础施工措施(内容)项目工程概况及工程量2.1工程概况xx集团塔山2×600MW机组坑口电厂锅炉房基础纵向为K1、K2、K3、K4、K5、K6六个基础轴线，基础底标高为-5.5m，±0.000相当于绝对标高（黄海高程）1074.8m。基础设计为钢筋混凝土独立基础,承台之间设连梁及剪力墙.其中CT-1基础2个，CT-2基础3个，CT-3基础2个，CT-4基础8个，CT-4a基础7个，CT-5基础2个，CT-5a基础2个，CT-5b基础2个，CT-6基础2个，CT-7基础4个，CT-8基础2个，CT-8a基础1个，CT-9基础2个，CT-10基础2个。基础承台上短柱最大断面2.2×2.2M,短柱顶标高为-0.6M.混凝土强度等级:基础、拉梁为C35（CT-6、8、8a为C40），短柱、剪力墙为C40。锅炉基础浇注时先浇注至—1.70m标高，待地脚螺栓和固定支架安装完毕后再浇至—0.60m标高。2.2主要工程量钢筋：Φ32101.4TΦ2866.2TΦ2526.2TΦ161.4TΦ148.9TΦ126.9Tφ1447Tφ1211.7Tφ1012.1Tφ85Tφ1648.3T砼：C401252m3C351372m33.作业准备工作及条件3.1作业人力计划木工60人钢筋工30人砼工15人架子工40人测量工2人机械工2人电工1人电焊工3人技术员1人质检员1人施工员2人3.2材料准备100×100方木10m３50×100方木8m钢管60T十字扣件12000个脚手板800块铅丝22#1250kg钢模板2200m2铅丝12#3.3机具准备反铲1辆自卸汽车5辆机动翻斗车2辆手推翻斗车10辆台钻1台对焊机1台磨光机2台振捣器6台砂轮切割机1台钢筋运输拖板车1辆泵车2台罐车3辆4.作业程序及作业方法4.1施工顺序测量放线→土方开挖→垫层施工→人工破桩→放线→基础承台钢筋绑扎→基础承台模板安装→基础承台混凝土浇筑→短柱钢筋绑扎→短柱模板安装→短柱混凝土浇筑4.2主要施工方法4.2.1土方开挖本基坑采用反铲作业，自卸汽车运土。放坡坡度为1:0.75，基底作业面宽度为1m，详见附图1。根据设计挖方图，锅炉间机械挖方控制深度为-5.6m，机械挖方控制深基底暂留土层为300厚人工挖土。坡道位置详见附图，坡道宽为7.0m。护栏距边坡顶缘1.5m处，高度1050mm,立杆间距2000mm，中间加设一道横杆，并刷红白相间油漆条纹。基坑挖土派专人修坡，要求上（下）口拉线修直，边坡顺直平滑。挖方土料运于指定堆土（或用土）场地，要求随时集中并整形。为防止风吹土扬，应拍实或淋湿土堆表面。随时抄平，控制挖方深度。及时放出底线，以免超挖或少挖。修坡时要借助靠尺挂线，做到坡面一致，边线顺直。4.2.2垫层施工土方开挖机械至-5.3m后将余下的0.3m人工挖除至-5.6m，基槽经设计人员、监理验收合格后用50×100方木支设模板，垫层砼表面抹平后用木抹子或棕刷拉毛。表面平整度的误差不超过10mm。4.2.3桩头施工垫层施工完毕后进行破桩头，严格控制桩头标高，保证伸入承台100mm。剔除时应注意保护好桩插入承台内的钢筋，剔除方法为风镐或凿子在桩侧面剔槽，将箍筋割除，主筋弯出，混凝土凿除，然后用机械运走。4.2.4架子工程脚手架搭设地基应平整夯实，并加设50木板、扫地杆，满铺脚手板，并用12#铅丝栓牢，不得有探头板，顶部加设双层防护栏杆。承台施工搭设双排操作架，脚手架立杆离基础边300mm左右，立杆纵向间距1.5m，水平间距1.5m，步距1.8m，小横杆间距1.2m。外侧加设剪刀撑和斜拉撑。剪刀撑不得大于45度。在承台内的立杆下加Φ32钢筋支撑，顶部焊L=100mm钢筋头，高出混凝土面100mm。搭设方法见附图2。4.2.5钢筋工程钢筋采用集中配制，现场绑扎，钢筋接头采用闪光对焊。绑扎钢筋前先在垫层上弹出基础轴线、柱边线轴线、板墙及四角并用红油漆标明。在基础边线内画出底板钢筋的位置，摆放并绑扎底板钢筋。柱钢筋、板墙和底板钢筋绑扎在一起，在基础顶部柱钢筋用钢管扣件框住并找准位置绑扎在钢管框上，钢管框和模板加固钢管连在一起，形成一个整体。钢筋绑扎时先绑扎底板受力主筋，然后安装模板支架（见模板工程），最后绑扎上部附加钢筋。钢筋保护层用1：2水泥砂浆制作，基础底保护层100mm，侧面及顶面为35mm，柱和拉梁保护层为35mm，剪力墙保护层为25mm。在垫块上设置22#铅丝绑扎在柱主筋上，呈梅花形绑扎@1000mm。4.2.6模板工程基础及柱采用竹胶模板，模板加固基础用钢管围檩和M12对拉螺栓杆加固@750×600.详见附图3。上层台阶悬空模板用Φ20钢筋支架架设，间距1.5m设置一道。在基础四周打入钢管地锚用钢管斜撑加固，使整个基础成为一个整体。模板支设必须涂刷隔离剂，拆模要按照先支后拆，先支后拆的顺序进行，由高到低自上而下拆，拆除时严禁猛撬、猛砸，破坏砼棱角和表面。4.2.7砼工程混凝土由搅拌站集中供应,罐车运送,泵车布料,混凝土搅拌时严格按试验室配合比进行试配,计量器具必须经过验定,计量要准确.混凝土浇灌采用全面分层法,拉梁及板墙采用斜面分层法.混凝土浇注一次成型,施工缝留在承台与短柱交接处.暂留K5轴CT-4a不施工,以便泵车进入基坑内浇注混凝土,待其他承台施工完毕后最后施工此承台.混凝土振捣采用插入式振捣器,插点间距不得大于500mm,混凝土分层厚度不得大于300mm,承台基础浇注时要严格控制初凝时间,第一台阶浇注后初凝以前必须浇注第二阶,不得留施工缝.振捣上一层砼时要插入下一层砼5cm左右，振捣棒要快插慢拔，插点均匀，每次振捣到砼不再下沉，表面不再出现气泡，泛出灰浆为止。基础柱及剪力墙浇筑时，下方先浇筑5～10cm同配比的水泥砂浆，以防止烂根。振捣时振捣棒严禁触及钢筋模板。为了防止砼表面出现裂缝，应加强二次振捣。混凝土表面用木抹子搓平、压实、拉毛。冬季混凝土施工要求①砼拌合物的出机温度不宜低于10°C，混凝土入模温度不得低于②为了减少冻害，应将配合比中的用水量降低至最低限度。③冬期施工要及时掌握气候变化情况，项目工程部、土建试验室应经常与气象部门取得联系，并及时将气候的变化情况通知各专业分公司工程部，分公司工程部应及时将天气的变化情况通知主管生产经理及各项目负责人，便于尽快采取有效措施。混凝土浇筑后，混凝土周围用一层塑料布一层棉被覆盖，同时做好测温工作，发现混凝土温度下降过快或遇寒流袭击，应立即采取加强保温层措施。冬季施工应配备棉被应急，遇强冷天气应及时加盖棉被。砼试件的留置除按正常温度施工留置外，应当增设不少于两组与结构同条件养护的试件，分别用于检验受冻前的砼强度和转入常温养护28d的砼强度。④模板和保温层应在混凝土冷却到5℃后方可拆除。当混凝土与外界的温差大于20℃时，拆模后的混凝土表面应临时覆盖，使其缓慢冷却。⑤冬季施工期间，施工单位应与气象部门保持密切联系，随时掌握天气预报、寒潮、大风警报，以便及时采取防护措施。eq\o\ac(○,6)冬季施工为保证混凝土入模温度,在混凝土搅拌站设专用水箱,采用蒸汽加热拌合水的方法提高混凝土的温度,骨料不加热,水温不得大于80℃.拌合水的温度应随时检查，根据混凝土的出机温度适当进行水温的调整。混凝土运输采用罐车,冬季为保证热量散失,在罐体外包裹专用保温棉套。在混凝土浇注过程中尽量加快浇注速度,以免热量散失。大体积混凝土施工本工程柱基和基础柱均为大体积混凝土，为了减小大体积混凝土温度裂缝的产生，必须采取如下措施：①掺粉煤灰（粉煤灰为Ⅱ级），宜减少水泥用量。②掺缓凝剂砼初凝时间为4～6小时。③选择合宜的砂石级配尽量减少水泥用量，使水化热相应降低，砂含泥量控制在2%以内，石子选用5～40mm，含泥及石粉量小于1%。④尽量降低每立方米混凝土的用水量。⑤降低混凝土的入模温度。⑥加强保温（一层塑料布、一层棉被）。⑦水泥选用32.5矿渣水泥。⑧延长混凝土的拆模时间。大体积选CT-6和CT-8基础进行测温，每个基础设一处，分上、中、下三个测点，测温管使用4分管制作，测温管均露出混凝土面20mm，测温管布置见附图4。混凝土浇注后每个2小时测温一次，并做好测温记录，当内部与表面温差大于25℃时应增加棉被的厚度，以减少温差。混凝土柱分二次浇筑，第一次浇筑至-1.7m，第二次浇筑至-0.6m，两次浇筑至界面应凿毛清洗干净，并充分湿润，待混凝土强度达到70%以上，固定支架方可就位。由于锅炉基础柱断面较大，浇筑混凝土时应循环浇筑，每次浇筑时，不能一次浇筑而成，应分层浇筑。保温层厚度计算：δ=0.5hλχ(T2-Tq)Kb/λ(Tmax-T2)其中h=3500mm,λχ—所选保温材料导热系数[W/（mk）]取0.14T2-Tq—砼表面与大气温差，取10℃Tmax-T2砼中与表面温差，取25Kb—传热系数修正值，取1.3λ—砼导热系数，取2.33W/(mk)∴δ=0.5×3.5×0.14×10×1.3/25×2.33=0.055=55mm.因此由计算得出保温层为一层塑料布，58mm厚棉被保温养护。4.2.8土方回填考虑到锅炉０m以下土方回填为冬季施工，故必须严格按照冬季施工措施和规范要求施工。填方前清除基底上的冰雪和材料；回填可采用含有冻土块的土料，但冻块粒径不得大于15cm，含量不得超过15%，且均匀分布；每层铺土厚度比常温施工时减少20～25%。回填前在基础上做出回填厚度标志，回填土质符合图纸要求。初步整平后碾压或打夯，分层回填分层试验，压实系数按设计院要求执行，由实验室取样合格后方可回填下一层，回填土的分层厚度机械回填虚铺300mm，蛙式打夯机回填虚铺250mm，人工回填200mm。施工人员及质检人员需加强回填土的过程控制。分层回填，分层试验，经试验合格后方可进行下一层土方的回填。冬季进行土方回填作业是要严防虚土受冻，土方摊开后应立即进行碾压，夜间停止作业时应保证最后一层是虚土，并在虚土上满铺2层麻袋进行保温。回填土碾压或打夯按一定方向进行，一夯压半夯，分层夯实、夯夯相连，每遍纵横交错，每层接缝作成台阶形，夯迹重叠0.5～1m，上下层接缝错开1m以上。基础四周用跳夯夯实。4.2.9成品保护措施为保持混凝土柱棱角完整，锅炉基础柱拆模后用蓝色塑料布包裹两层，再用∠50×5保护，中间间隔500mm用-50×55.作业质量标准5.1作业质量标准钢筋：模板：骨架长≤10mm轴线位移≤5mm箍筋间距±20mm基础截面尺寸+2～-5mm主筋间距±10mm标高偏差±5mm主筋排距±5mm模板垂直度≤2mm主筋保护层±5mm表面平整度≤2mm砼：长度偏差±5mm截面尺寸±5mm标高偏差0～-10mm表面平整度≤5mm5.2作业操作质量要点及保证措施5.2.1材料及半成品进厂必须有合格证及检验报告。必检项目复检合格后，报监理验收合格方可进行。5.2.2分项工程质量检验执行四级验收制度，即班组自检、专业公公司复检、项目部专业检验与建设单位和监理共同检验。上一道工序验收合格后方可进行下一道工序施工。5.2.3钢筋对焊需持证上岗，对焊前需作班前件、合格后才能成品对焊。5.2.4钢筋配制前先调直，绑扎前核对钢筋品种数量，准确无误后才可绑扎。5.2.5模板支设前先整平打磨，刷隔离剂，有翘曲的模板严禁使用，使用木模须刨光。5.2.6模板加固牢固自成一体，连接件齐全，对拉螺杆、螺帽拧紧，浇灌砼时设专人看护模板，发现异常立即采取加固措施。5.2.7砼连续浇筑，中途停歇不超过2小时，砼要振捣密实，无漏振，表面压光。6.作业的安全措施6.1本项目作业一般安全措施6.1.1进入现场人员必须经三级安全教育考试合格后才准上岗。6.1.2施工现场作业人员必须统一着装，正确佩戴安全帽，高处作业必须系好安全带。6.1.3机械操作必须持证上岗，所有机械运转良好，不得带病作业，现场机动车辆时速限制在5公里/小时以内。6.1.4脚手架由专业架子工搭设，验收合格后方可使用，施工过程中严禁任何人私自拆搭脚手架，脚手架负载不超过270kg/m2。立杆下垫垫木，并设扫地杆。6.1.5所有电动机械设备要一机一闸一保护，非电工严禁私自拆安电气设备，夜间施工要有充足的照明。6.1.6砼振捣人员和打夯机操作人员要衣着灵便，戴绝缘手套，