土壤中细菌分离纯化和鉴定

土壤中细菌分离、纯化和鉴定摘要：在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法。这一过程称为微生物的分离纯化。本文将提取泥土中所包含的微生物，并且分离、纯化，最后对其微生物种类进行鉴定。关键字：泥土细菌分离纯化鉴定1、实验材料：分离细菌的材料：样品：新鲜土样培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL）。无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水的三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其他：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水泡锅。试剂：5000U/mL链霉素液，％重铭酸钾液。细菌纯化鉴定材料：染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%酒精、番红染色液。培养基：淀粉培养基、石蕊牛乳培养基、真菌培养基、试管斜面。试剂：碘液。其它：试管、三角瓶、移液管、接种针、接种环、培养皿。2、实验步骤制备土壤稀释液：1、称取土壤5甘，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。2、另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1的土壤液，振荡后静止，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5、10-6土壤稀释液。平板划线法：1、取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。2、凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10-5或10-6）在平板上划线。3、（1）连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28〜300C温室培养。分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28〜300C温室培养。4、挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。细菌的染色：革兰氏(Gram)染色法涂片、干燥、固定。初染：在做好的涂面上滴加结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。用吸水纸吸干。媒染：用路哥氏碘液将其覆盖涂面1分钟，后水洗，再用吸水纸吸干水。脱色：滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。吸干水。复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。镜检：观察染色结果并绘图。细菌生理生化实验：生理生化实验包括淀粉水解试验、硫化氢的产生实验以及石蕊牛奶试验。淀粉水解实验：用接种环在淀粉培养基的平板上每个菌种涂片~大小的圆，其中一种应以枯草杆菌作为对照。硫化氢产生实验：用新鲜斜面菌种接种到硫化氢液体培养基中，再用无菌镊子夹取醋酸铅滤纸条，借助棉塞悬挂于试管中培养基之上，下端接近液面但不可触及液面。培养7天观察。如滤纸条变黑为阳性，不变者为阴性。石蕊牛奶实验：用接种枪接种100uL菌液于石蕊牛奶培养基中，置于370C恒温箱内培养7d。另外保留1支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照.3、实验结果细菌菌落的形态特征图为细菌菌落菌落表面形态特性：形态圆形或不规则；边缘光滑或不整齐；大小不一，表面光滑或者褶皱；颜色不一，常见为灰白色、乳白色；湿润粘稠。菌落在培养基上着生情况：用接种环易从基质表面刮去菌落。细菌个体形态特征■、•1■11H%/XsY・rJ*KJIs2<1呈革兰氏阴性，且为杆状。细菌个体生理生化特征淀粉水解实验：细菌周围出现无色透明圈，证明该细菌拥有水解淀粉的能力。该细菌的透明圈大小明显小于枯草杆菌透明圈，略大于大肠杆菌透明圈。通过淀粉水解实验，可以看出该未知细菌能够水解淀粉，其水解能力小于枯草杆菌，与大肠杆菌相当。硫化氢实验：未知细菌不能使纸条变黑色。说明该细菌不能利用含硫有机化合物注意事项中提到，硫化氢的产生实验比较敏感，培养基不适用于肠杆菌科。所以不能排除该细菌是大肠杆菌的可能。石蕊牛奶实验：未知细菌与大肠杆菌的试管略微变蓝（与淡紫色相差不大，难以区分）。枯草杆菌试管呈粉红色，差异明显。实验可以看出，枯草杆菌能够利用发酵乳酸，是试剂变红。而未知细菌和大肠杆菌能够利用水解蛋白质，产生氨气等碱性物质，是石蕊变蓝。4、实验总结与实验心得通过以上实验，可以看出以下几点：1、该微生物菌落呈圆形，且较为光滑，菌落白色。2、在显微镜中可以观察到，该微生物为某种杆菌，且呈革兰氏阴性。3、通过生理生化实验可以看出，该细菌能够利用淀粉和蛋白质来提供营养。但其是否很够利用含硫有机化合物还不能够确定。从一系列对该细菌的提取、提纯、鉴定中可以看出，该细菌与大肠杆菌有很大程度上的相似性。经过这学期学习和实验操作，我对微生物实验有了一些初步的认识。微生物实验是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。在微生物实验中，我们学习了一下基础实验操作：（1）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。（2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。（3）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。（4）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。微生物实验课程很好的帮助我们了解总结了微生物学中的基本知识。通过实验这种实践的方式能够让我们更好的掌握所学的知识点，并且能够提高我们对微生物学的兴趣。我