发酵生产染菌及其防治

发酵生产染菌及其防治第1页/共34页染菌无法彻底避免；据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％~5%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为1％～2％染菌对发酵产率、质量、三废治理都有很大的影响。发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵的经验教训，且积极采取必要的措施，防止生产过程中染菌，把染菌消灭在发生之前。第2页/共34页一、染菌对不同发酵的影响青霉素：产青霉素酶的杂菌疫苗：全部废弃柠檬酸：主要防止前期染菌谷氨酸：噬菌体危害大肌苷、肌苷酸：易染菌第一节染菌对发酵的影响

第3页/共34页二、染菌发生的不同时期对发酵的影响（1）种子培养期染菌：发现种子染菌应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。（2）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。第4页/共34页（3）发酵中期染菌：发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大；抗生素发酵：将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施柠檬酸发酵：污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低pH，抑制细菌生长；污染酵母：加0.025-0.035g/L硫酸铜；第5页/共34页污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲霉自溶污染青霉：青霉能在低pH环境下生长，可考虑提前放罐。（4）发酵后期染菌产物积累较多，营养物即将耗尽。如染菌量不大，可继续发酵；如污染严重可考虑提前放罐。第6页/共34页

四、染菌程度对发酵的影响染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大。如果生产菌已在发酵液中占优势，污染少量杂菌，对发酵不会造成太大的影响。前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。

第7页/共34页第二节发酵染菌的途径分析（一）发酵染菌后的异常表现罐温异常升高发酵液pH异常变化溶解氧及CO2水平异常菌丝黏度的异常变化发酵液气味的异常变化发酵液中碳、氮含量的异常变化发酵液中产物量的异常变化泡沫异常菌体太浓或太稀第8页/共34页二、染菌的检查与判断1、染菌的检查（1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）：观察微生物的形态特征，检查是否有与菌种形态特征不一样的其他微生物在存在。（2）平板划线培养或斜面培养检查法；

平板制好后，应先保温24小时，确定无菌；划线后分别于37、27培养，一般24h后镜检是否有杂菌。第9页/共34页（3）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）样品直接接入灭菌的肉汤培养基中，分别于37、27培养，随时观察，并取样镜检。噬菌体检测时，用双层平板法，底层为肉汤培养基，上层琼脂减量，指示菌为生产菌。

第10页/共34页无菌实验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落，可判断染菌。有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，经镜检等其它方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也可判断为染菌。无菌实验的肉汤或平板应保存并观察至本批放罐后12h，确认无菌后才能处理。无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品。第11页/共34页三、发酵染菌原因分析发酵的染菌率（指一年内发酵染菌批数与总投料批数之比）发酵染菌批数总投料批数总染菌率＝×100％染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。第12页/共34页染菌原因分析

染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。第13页/共34页（一）染菌的杂菌种类分析

杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等）杂菌是真菌（可能是设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当）第14页/共34页（二）染菌的规模分析大批量发酵罐染菌：种子、空气；

前期：种子带菌，灭菌问题；

中后期：空气带菌；部分发酵罐染菌：前期（种子染菌、连消系统灭菌不彻底）；后期（可能是中间补料染菌）个别发酵罐连续染菌：大都是由于设备渗漏第15页/共34页（三）染菌的时间分析种子培养阶段：种子、灭菌、接种操作或设备因素；发酵前期：种子、灭菌、接种操作、空气带菌等；发酵后期：空气、补料、设备渗漏、泡沫顶盖、操作问题第16页/共34页第三节杂菌污染的途径和预防一、种子带菌的防治种子带菌原因：斜面菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移接种过程染菌和种子培养设备装置污菌等。第17页/共34页种子带菌的防治方法：（1）严格控制无菌室的污染，交替使用多种方法对无菌室灭菌。（2）制备种子时对砂土管、斜面、三解瓶及摇瓶均要严格管理，防止杂菌进入。（3）对每一级种子严格进行无菌检查，确保任何一级种子未受杂菌感染。（4）培养基及用具灭菌要彻底，高压灭菌时要完全排净冷空气应防止假压,达到不到所需的温度；第18页/共34页二、空气带菌及其防治空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。第19页/共34页二、空气带菌及其防治措施：从空气净化流程和设备设计、过滤介质的选用和填充灭菌和管理方面完善，加强卫生管理，减少含菌量，正确选择采风口，设计合理工艺，加前置粗过滤器、降低空气湿度、保持过滤介质干燥、防止空气冷却器漏水等第20页/共34页三、操作失误导致染菌及防治

主要指培养基和设备灭菌不彻底原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；措施：可升温前搅拌和加淀粉酶。麸皮、黄豆饼等固形物溅到罐内各种支架上，堆积不易彻底灭菌。措施：预先配料实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。第21页/共34页灭菌中产生泡沫，严重时可升至罐项，泡沫内带菌，温度低于灭菌温度，导致存活。措施：措施消泡剂，严防泡沫升顶。连续灭菌时，温度和时间要符合要求。蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。第22页/共34页四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防止设备渗漏：指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等形成微小漏孔后发生渗漏染菌。“死角”：由于操作、设备结构、安装及其他人为因素，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位。如盘管、空气分布管、发酵罐部件、管件等。第23页/共34页常见的设备、管道“死角”发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。第24页/共34页第25页/共34页管道安装不当形成的死角第26页/共34页第27页/共34页五、噬菌体污染和防治噬菌体是细菌病毒，可通过环境污染、设备渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。利用细菌或放线菌发酵的生产易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，较难防治，对发酵有很大威胁。第28页/共34页噬菌体污染症状氨基酸发酵中，光密度不上升或回降；pH逐渐上升，可到8.0以上；氨的利用停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫；谷氨酸产量少，甚至找不到完整的菌体，CO2排出量异常；发酵周期延长；发酵液泡沫多、难中和取分离困难，收率低。第29页/共34页（1）、噬菌体的防治

是一项系统工程，从培养基制备灭菌、种子培养、空气净化系统、环境卫生、设备、管道等诸多方面，具体归纳如下：

①严格活菌体排放，切断噬菌体的来源②做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌③严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内④抑制罐内噬菌体的生长第30页/共34页（2）、污染噬菌体后的处理方法

①并罐法②转换使用菌种或使用抗性菌株

③放罐重消法④罐内灭噬菌体的方法

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六、杂菌污染的挽救与处理

1、种子培养期染菌的处理

灭菌、重新制种、倒种

2、发酵前期染菌的处理

重新灭菌接种发酵、危害较大的可入掉部分料液，补充新鲜培养基灭菌接种发酵；第32页/共34页3、发酵中后期染菌的处理

可加入适当的杀功菌