基因启动子新

基因启动子新第1页/共39页Newwords1、promoter[prəu'məutə]启动子2、geneticexpression[dʒɪ'netɪk][ɪk'spreʃ(ə)n;ek-]基因表达3、element['elɪm(ə)nt]n.元素；要素；元件4、enhanser5、inducible[in'dju:səbl]adj.可诱导的；可导致的6、lactoseoperon['læktəus]['ɒpərɒn]乳糖操纵子第2页/共39页主要介绍内容：一、启动子结构的发现二、启动子的元件(promoterelement)三、启动子的类型(promotertype)四、启动子的特点（Promotercharacteristics）五、启动子的序列分析(Promotersequenceanalysis)第3页/共39页启动子

1、启动子：位于结构基因5’端上游、能够指导RNA聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。

Promoter:locatedinthestructuralgene5'upstream,canguidetheRNApolymerasewithtemplatecorrectly,startaDNAsequenceofthegenetranscription

第4页/共39页一、启动子的发现过程Pribnowdesignedanexperiment,heputtheRNApolymeraseholoenzymewithprokaryotestemplateDNAbinding,DNAhydrolysiswithDNase,andthenextractedwithphenol,theprecipitatepurifiedDNAobtainedafteraprotectedRNApolymeraseDNAfragment,about41~44nucleotidepairs.HehasseparatedfdphageT7bacteriophageA2andA3promoterPRpromoterofmacrophagesσbacteriaandE.colilactoseoperonUV5promoterparagraph5enzymeprotectedarea,andsequenceanalysislaterwasdoneover50promotersequenceanalysisrevealedthat,intheprotectedareashaveacommonsequenceoffivenucleotides,RNApolymerasecloselyintegrated,nowknownasthePribnowDistrict(Pribnowbox),thecenteroftheareaisapproximatelylocatedthestartingpointattheupstream10bp,itisalsoreferredtoasthe-10region.Laterfoundat-35bpthetheanothercommonsequences(TTGACA)第5页/共39页Ineukaryoticgenes,Hogness,etc.globingenefirstdiscoveredsimilarPribrowzoneHognesszone(Hognessbox),whichislocatedupstreamofthetranscriptioninitiationpointat-25~-30bpthecommonsequencelikeTAAA,alsoknownasastheTATADistrict.At-70~-78bpupstreamofthestartsiteSterileanothersectionofthecommonsequenceoftheCCAATsequencecorrespondingwiththethe-35bpDistrictprokaryotes.CalledtheCAATarea(CAATthehox).第6页/共39页二、启动子元件真核启动子中包含了许多调节基（regulatorgene）转录的元件，它们控制着基因表达的强弱或者时空差异。根据对基因表达（geneticexpression）的必须性，这些元件分为2类：核心启动子元件（corepromoterelement）和上游启动子元件(upstreampromoterelement)第7页/共39页

（1）TATA框(TATAbox)：位于5′端转录起始点上游约20-30个核苷酸的地方。TATA框是一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接触点，它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。（2）CAAT框(CAATbox)：位于5′端转录起始点上游约70-80个核苷酸的地方。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA的形成量会明显减少。1.核心启动子元件(corepromoterelement):

指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和CAAT盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。第8页/共39页

2.上游启动子元件(upstreampromoterelement):包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的时间与空间表达调控。这些上游启动子元件中，最普遍的是增强子元件。第9页/共39页3.增强子（enhancer）

是一种能够提高同一条DNA链上基因转录效率的顺式调控元件。最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物和原核生物中都发现了增强子。增强子通常长100－200bp，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8－12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。第10页/共39页病毒来源的35S启动子的结构+9-90-343DomainA

DomainB

DomainA:与在根部起作用有关。DomainB：是烟草转录因子ASF-1的结合部位，与在植物叶片、茎等绿色组织中起作用有关。上游部分：与转录强度有关（增强子功能）。含有重复的-343—-90部分的35S启动子比350bp的35S启动子的强度大10倍。35S启动子的核心长度为60bp左右；其上游有其它元件，控制启动子的转录效率(Transcriptionefficiency)和特异性(specificity)，其中包括增强子(enhanser)。增强子第11页/共39页

11281tttcccgccttcagtttagcttcatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaac11341tcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaaga11401aaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagata11461cagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacc11521tcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaag11581gtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctg11641ccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacg11701ttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatg11761acgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctat

ataaggaagttcatttcatt11821tggagagaacacgggggactcttgac花椰菜花叶病毒35S启动子=CaMV35S启动子TATA框(TATAbox)CAAT框(CAATbox)第12页/共39页三、启动子的类型：1.组成型启动子(constitutivepromoter)2.诱导型启动子(induciblepromoter)3.特异型启动子(tissue-specificpromoter)植物来源的微生物来源的Stress/wound-induciblepromoters外源诱导启动子第13页/共39页1、组成型启动子CaMV35S启动子是一个病毒来源的组成型启动子（constitutivepromoter），不仅可以能在双子叶植物中高效启动基因表达，而且在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。另外CaMV35S启动子内部没有我们常用的酶切位点(RestrictionEnzymecuttingsite)，因而容易克隆和使用，在植物基因工程（geneticengineering）中得到了广泛的应用。茎叶片横切面根花幼苗35S启动子控制的GUS基因在烟草中表达第14页/共39页.植物来源的组成型启动子在植物中有很多看家基因，在各种类型细胞和所有时间内都表达。启动这些基因表达的启动子就是组成型启动子。现在许多这类启动子已经被克隆，并在植物基因工程得到了应用。

肌动蛋白（actin）是细胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是组成型基因，其启动子就是组成型启动子。通过检测报告基因的表达，发现1.5kb的拟南芥actin2基因启动子几乎在拟南芥所有器官和整个发育过程中都起作用，仅在种皮、胚轴、子房和花粉囊中不起明显作用。

水稻的actin1基因启动子仅不在木质部中起作用。第15页/共39页拟南芥ACTIN2基因启动子分析第16页/共39页第17页/共39页原核生物组成型启动子之二：农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子NospromoterNospromoter35SpromoterNospromoter烟草卫矛第18页/共39页2.诱导型启动子（InduciblePromoters）1.Stress/wound-induciblepromoters：病原菌、害虫、低温、高温、水涝、干旱、高盐、创伤等都可以引起植物的一些特殊反应（基因表达的结果），由此而得到一些受这些因素诱导的启动子。马铃薯创伤启动子wun1（创伤启动子）andproteinaseinhibitorII(pin2，蛋白酶抑制剂)genepromotersbothdirecthighwound-andpathogen-inducibleexpression,buthavelittletonoconstitutiveexpressionwithoutstimulus。The1.2kbwun1promoterfusedtoreportergenesshowedveryhighlevelsofexpressionatthesiteofwoundingandpathogenattack。Reportergeneinductionwasmaximalat10h.TheArabidopsisrd29Aandrd29B基因启动子受到干旱、高盐的诱导。第19页/共39页2.外源诱导启动子优点：1）可以随意控制（诱导时间和诱导的剂量）；2）重复控制；3）植物内部背景低。Mostinducible/repressiblepromotersystemsaretwo-componentsystemswithmolecular‘on-off’switchesthatvaryincomplexity.Theyincludeatranscriptionfactorgenewhoseproduct,whenselectivelyexpressed,bindstoa‘target’promoterthatcontainsthetranscriptionfactor’scis-actingelement.Thetargetpromoterisfusedtothetransgeneofinterestandthebindingofthetranscriptionfactormodulatesitsexpression第20页/共39页35S启动子转录因子基因转录因子+诱导剂（Cu2+,酒精,等)基因表达外源诱导启动子系统作用示意图结合转录功能基因诱导型启动子第21页/共39页乙醇诱导系统:Thealcsystemisextremelysensitivetoethanolandisinducedrapidlyandinadose-dependentmanner.Thetargetgeneisinducedbysoilrootdrenching(0.5%v/vethanol),hydroponics(0.1%v/vethanol),andfoliarsprayingofmatureplants(5%v/vethanol).Ithaslowtonobasalexpressionofthetargetgene,andithastheadvantageofaninducerthatisinexpensiveandnontoxicattheeffectiveconcentrations.InductionoftargetgeneexpressionwassimilartothatofgenesdrivenbytheCaMV35Spromoter,butwasreversible.Onedrawbackisthatunderanaerobicconditions,plantsthatareknowntoexpressalcoholdehydrogenasearelikelytoactivatethissystemwiththeproductionofethanol,afermentationmetabolite.However,thissystemappearstobeoneofthemostpromisingforuseunderfieldandcommercialconditions.第22页/共39页Tetracyclineandhormone-induciblesystems（四环素和激素诱导系统）包括Tetracycline(四环素)induciblesystem,estrogen(雌激素)induciblesystem,ecdysone(蜕皮激素)induciblesystem,和glucocorticoid(糖皮质激素)-basedsystem.第23页/共39页（1）、

组织特异启动子（tissue-specificpromoter）（2）、块根/块茎储藏器官特异启动子（3）、果实特异性启动子（4）、花粉/花药特异启动子（5）、根特异启动子（6）、花/花序特异启动子

(7)、叶片/绿色组织特异启动子（8）、细胞器特异启动子3.特异启动子第24页/共39页（1）组织特异启动子（tissue-specificpromoter）植物维管组织特异启动子第25页/共39页（2）根特异启动子Agrobacteriumrhizogenes

rolD

基因启动子（373-426bp）、90bp的35S启动子具有根特异性；烟草的TobRB7启动子、Arabidopsisthalianapyk10启动子、松树PmPR10-1.14启动子。第26页/共39页(A)2-day-oldseedling;(B)3-day-oldseedlingshowingGUS-stainingthroughoutthewholeplant,withexceptionoftheelongationzoneoftheroot;(C)5-day-oldseedlingwithareductionofgus-activityincotyledons;(D)7-day-oldseedlingshowingthatthehypocotylisnomorestained;(E)10-day-oldseedlingwithnoGUS-stainingintheupperpartsoftheplant;(F)14-day-oldseedling;(G)stainedrootsshowinggus-activityalongthewholemainroot;(H)transitionzonebetweenhypocotyleandroot.(I–T)Gus-activityundercontrolofthepromoterconstructC,(I)2-day-oldseedling;(K)3-day-oldseedling;(L)5-day-oldseedling;(M)7-day-oldseedlingwithoutGUS-staininginthehypocotyl;第27页/共39页(N)10-day-oldseedlingshowingGUS-stainingincotyledons,inthemidribregionandmarginalpartsoftheleavesandinhydathodes;(O)14-day-oldseedlingwithastrongreductionofgus-activityintheupperpartoftheplant;(P)stainedrootsshowingastronggus-activityalongthewholemainroot;(Q)close-upofstainedrootsshowinggus-activitypreponderantlyinthecentralregionoftherootorinthewholeroot;(R)close-upofastainedrootshowinggus-activityintheouterpartsoftheroot;(S)close-upofstainedroottipsandroothairs;(T)lateralrootswithGUS-stainingonlyintheroottip;(U–W)stainedcrosssectionsofmainroots;(X)stainedcrosssectionneartheroottip;(Y)close-upofapodabscissionsite.第28页/共39页（3）.果实特异性启动子果实是食用器官，利用果实特异性启动子可以改良果实品质、生产疫苗。苹果和番茄果实中1-aminocyclopropane-1-carboxylate(1-氨基环丙烷-1-羧酸，ACC)oxidasegene（E8gene）和polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶，PG)genes启动子在果实成熟是起作用。番茄PG启动子用来提高番茄果实中胡萝卜素的含量；番茄E8启动子表达virus-Fprotein，生产疫苗，提高了老鼠系统免疫能力。第29页/共39页（4）叶片/绿色组织特异启动子属于光诱导型启动子研究最清楚的是编码ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）小亚基的rbcSmultigenefamily的启动子。另外，chlorophylla/b-binding(Cab)proteingenes的启动子.。第30页/共39页（5）.花粉/花药特异启动子烟草花粉(pollen)特异启动子TA29,番茄花粉特异启动子lat52，水稻花粉特异RA8gene启动子、玉米ZmC5基因启动子、ZM13启动子都是花粉特异启动子.花粉特异启动子被广泛用来创造核雄性不育植物(Nuclearmalesterileplants)。花粉特异启动子–barnase(RNase)载体(vector)已经用来转烟草、油菜、水稻、玉米等；花粉特异启动子还可以进行基因删除，防止外源基因(exogenousgene)通过花粉污染其它非转基因植物(Nontransgenicplants)，提高转基因作物的生物安全性。第31页/共39页（6）细胞器特异启动子叶绿体基因工程：在叶绿体表达外源基因。优点：1）叶绿体基因组小，没有位置效应，转基因不会沉没；2）表达量高，可以达到10000叶绿体/细胞；3）花粉中没有叶绿体，所以没有基因逃逸，安全。

Chloroplasttransformationvectorsmostoftenincludealight-responsivepromoterpsbA,aphotosystemIIpromoter，andrbcL,thepromoterfortheribulose-1,5-bisphophatecarboxylaselargesubunitgene,andthe16SrRNA(Prrn),astrongandconstitutiveplastidoperonpromoter.第32页/共39页（7）块根/块茎储藏器官特异启动子B33andPAT21是土豆的糖蛋白的主要成员，分析表明B33andPAT21基因的表达最主要是在块茎形成的过程中，表明B33andPAT21基因的启动子是块茎特异性的。Sporamin（红薯特殊贮藏蛋白）andβ-淀粉酶是红薯块根中2个主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin几乎都在块根中表达（1%–4.5%在茎中)。第33页/共39页（8）.花/花序特异启动子花是重要的观赏器官，花色、花形、花的寿命和香气等是花卉重要性状。

1.45kb的菊花内源ubiquitinextensionprotein基因启动子(UEP1)在花中的作用是在叶片中作用的9倍，比CaMV35S启动子在菊花中的作用高40–85倍。控制拟南芥花瓣中蜡质合成的基因（CER6）启动子也可以在菊花花瓣中特异起作用。拟南芥leafy,ap1,ap3，PI等花器官发育基因的启动子第