外源基因表达

外源基因表达第1页/共11页第七章外源基因表达一、表达机制1．起始转录：转录起始的速率是gene表达的限速步骤，用诱导型启动子（Lac、Trp、PL/PR、tac、组成型启动子：T7）2．MRNA延伸与稳定：正常终止序列、减少DNA反向转录产生反义mRNA、polyA掺入对3’正确加工3．MRNA有效翻译：AUG首选起始codon、SD序列与16srRNA互补结合，含有至少AGGAGG中4个碱基、SD与ATG间距离3-9bp、翻译起始区周围不形成明显二级结构、codon选择性相近（没有明显偏好性不同）4．Pr稳定性：构建融合pr、分泌pr、包涵体pr、pr水解酶缺陷型受体细胞第2页/共11页第七章基因表达系统外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适受体细胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物1．E.coli表达系统：常用lac&tac：以lac操纵子调控机制为基础：lacPlacO结构基因（lacZ,Y,A），lacI阻遏pr，IPTG诱导，PL&PR：以phage溶原/溶菌循环T7启动子：T7RNA聚合酶识别序列在pET中MCS上端，RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因组中，上端为lac启动子调控，IPTG第3页/共11页第七章基因表达系统外源pr表达形式：包涵体pr：融合pr：寡聚型pr：多表达单元重组、多顺反子、多编码序列第4页/共11页第七章高效表达策略优化表达载体设计：启动子和mRNA中SD序列优化，强启动子，SD—ATG间距，RBS茎环结构稀有codontRNA，外源mRNA稳定性、外源pr稳定性：pr分泌胞外，prE缺失，prE敏感序列修饰，pr稳定性因子优化发酵过程：工艺生物学：菌体生长，表达条件，产物总量第5页/共11页TheexpressionvectorMostimportantelementsinthevectorPromoter-35:TTGACA(E.coli)-10:TATAAT(E.coli)Terminator(hairpin)Ribosomebindingsite(RBS)SelectionmarkerVectorreplicationsequence(ori)Polylinker(MCS)Inthegene/vectorStart(ATG)Stop(1-2TAA,(TAG,TGA))Signalpeptide第6页/共11页tacpromoterHybridpromoterfusionfromlacandtrppromoters+ CombinesstrongRNApolymerasebindingsequences+ 5xstrongerthanlacpromoter+ 20-30%oftotalprotein+ InducedbyIPTG第7页/共11页lPLpromoterIsolatedfromlbacteriophage-repressor(cI)bindstolPLpromoter+/- cI857variantheatinducible>30degrees,expression+/- Alternativelyusespecialstrainswithrepressorunder controloftrppromoterwhichisinducedbyTrpaddition+ Tightlyregulated-goodfortoxicproteinsTargetproteinTargetgenelPLRepressorgenecIrepressortrppromoterTrp++第8页/共11页T7system(pET-system)T7RNApolymerasegenecontrolledbylacpromoterIPTGinducesT7RNApolymeraseproductionT7RNApolymerasetranscribesgenecontrolledbyT7promoterTargetgenecannotbeactivatedbyhostRNApolymeraseSpecialstrainneededlacOinpETandpLysSreducesleakiness第9页/共11页GALsystemGeneclonedundercontroloftheGAL4promoterInductionbygalactoseasthesolecarbonsourceStrongerinductio