抗体的标记医学知识专家讲座

目录第一节标识物种类及特征第二节常见交联剂种类及特征第三节放射性核素与抗原抗体结合物制备第四节荧光素与抗原抗体结合物制备第五节酶与抗原抗体结合物制备第六节化学发光剂与抗原抗体结合物制备第七节稀土离子与抗原抗体结合物制备第八节量子点与抗原抗体结合物制备第九节胶体金与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第1页第一节标识物种类及特征抗体的标记医学知识专家讲座第2页重点提醒放射性核素荧光物质酶和酶作用底物化学发光剂量子点胶体金抗体的标记医学知识专家讲座第3页第一节标识物种类及特征标识免疫技术=免疫技术+标识技术

抗原抗体反应示踪标识物高特异性高灵敏性精密仪器检测高精密性既能够与抗原或抗体相结合，又能够被对应仪器所检测物质，这就是标识物标识物在免疫分析中作用在于示踪标识并能够被检测抗体的标记医学知识专家讲座第4页一、放射性核素在自然条件下可发生自发性转化，由一个放射性核素转变为另一个放射性核素，并同时释放射线，这一转变过程称为放射性衰变。依衰变方式分为：α、β、γ。抗体的标记医学知识专家讲座第5页一、放射性核素惯用标识核素

125I3H理化性

活泼

差标识方法简单复杂对标识物免疫活性影响小大射线γβ半衰期60d12.3y测量条件简单复杂抗体的标记医学知识专家讲座第6页放射性核素125I特点化学性质较活泼，标识方法简单，轻易获取高比活性标识结合物；衰变过程不产生电离辐射强β射线，对标识多肽，蛋白抗原分子免疫活性影响小；衰变过程中释放γ射线，可用γ计数器测量，方法简便，易推广应用；半衰期(60天)适中、核素丰度(>95％)及计数率相对较高。抗体的标记医学知识专家讲座第7页二、荧光物质有机化合物荧光素稀土离子螯合物荧光底物（酶作用后产生荧光物质）抗体的标记医学知识专家讲座第8页荧光素异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）四乙基罗丹明（rhodamine,RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）藻红蛋白(phycoerthrin,PE)抗体的标记医学知识专家讲座第9页惯用荧光素特征荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC衬比染色或双标识FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC衬比染色或双标识FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标识FAT、流式细胞术抗体的标记医学知识专家讲座第10页稀土离子镧系元素属于三价稀土离子，包含铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽(Tb3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）di和铈(Ce3+)等。铕是标识抗原抗体应用最广元素。游离稀土离子荧光比较弱，但与适当螯合剂如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使荧光得到增强。稀土离子荧光特征以下：含有较大Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互重合。荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000μs之间。激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。抗体的标记医学知识专家讲座第11页其它荧光物质一些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便含有强荧光。如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶作用后分解成4-甲基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其它如碱性磷酸酶底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶底物（对羟基苯乙酸）等，都含有荧光底物性质。抗体的标记医学知识专家讲座第12页三、酶和酶作用底物惯用酶标识物有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)每种酶可与对应显色或发光底物作用，产生经典有色反应物或化学发光反应，经过反应颜色或发光强度对被检物进行定性、定量分析。抗体的标记医学知识专家讲座第13页辣根过氧化物酶HRP辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为主要ELISA中应用最为广泛标识用酶抗体的标记医学知识专家讲座第14页碱性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

抗体的标记医学知识专家讲座第15页HRP底物HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有各种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体专一性很高

抗体的标记医学知识专家讲座第16页HRP常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS惯用底物抗体的标记医学知识专家讲座第17页OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛底物。

HRP常见底物

抗体的标记医学知识专家讲座第18页对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylaceticacid，HPA）HPA含有荧光底物性质，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长荧光。H2O2HRP+荧光氧化二聚体抗体的标记医学知识专家讲座第19页ALP底物惯用ALP色原底物对-硝基苯磷酸盐（p-nitrophenylphosphate，PNP）氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（nitro-blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate，BCIP/NBT）4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferylphosphate，4-MUP）是ALP发光底物之一。抗体的标记医学知识专家讲座第20页ALP底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）经AP作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

惯用底物BCIP/NBT惯用于ELISPOT中PVDF膜显色，在ALP催化作用下，BCIP被水解生成强反应性产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性深蓝色至蓝紫色沉淀抗体的标记医学知识专家讲座第21页4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm激发光作用下，发出450nm荧光，可用荧光光度计进行测量。荧光AP360nm激发光H3PO4+抗体的标记医学知识专家讲座第22页β-Gal荧光底物β-Gal底物

4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。惯用4-甲基伞酮基-β-D半乳糖（4-methylumbellifery-β-D-galactoside，4-MUG）作为底物，酶促反应后，产生高强度荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。抗体的标记医学知识专家讲座第23页四、化学发光剂在化学发光反应中参加能量转移并最终以发射光子形式释放能量化合物，称为化学发光剂或发光底物。直接化学发光剂酶促反应发光剂抗体的标记医学知识专家讲座第24页直接化学发光剂直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶催化作用，直接参加发光反应，它们在化学结构上有产生发光特有基团，可直接标识抗原或抗体。抗体的标记医学知识专家讲座第25页吖啶酯在碱性条件下与H2O2

就可产生化学发光现象。在碱性介质中氧化时，这些化合物经历共价键断裂，经过一个二氧酮中间体，产生电激发N-甲基吖啶酮，当它恢复到基态时，在430nm出释放出光子。抗体的标记医学知识专家讲座第26页AE特征化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特结构使其使用期长达1年甚至更久。发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内完成。抗体的标记医学知识专家讲座第27页电化学发光剂是指经过在电极表面进行电化学反应而发出光物质。特点：①反应在电极进行；②电子供体为：三丙胺（TPA）③化学发光剂：三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图抗体的标记医学知识专家讲座第28页电化学发光剂抗体的标记医学知识专家讲座第29页酶促反应发光剂酶促反应发光剂：是利用标识酶催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光发光剂称为酶促反应发光剂。鲁米诺及其衍生物AMPPD抗体的标记医学知识专家讲座第30页鲁米诺及其衍生物鲁米诺发光原理抗体的标记医学知识专家讲座第31页鲁米诺及其衍生物鲁米诺增强发光反应原理抗体的标记医学知识专家讲座第32页AMPPDAMPPD〔3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕抗体的标记医学知识专家讲座第33页五、量子点抗体的标记医学知识专家讲座第34页量子点QDs量子点(quantimimdots,QDs)即半导体纳米粒子，是指半径小于或靠近于激子玻尔半径半导体纳米晶粒（1-10nm）。由II-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接收激发光产生荧光，含有类似体相晶体规整原子排布。广义量子点还包含IV-VI族、V-VI族元素组成纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米颗粒等。抗体的标记医学知识专家讲座第35页量子点光学特征荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强所谓光漂白是指由光激发引发发光物质分解而使荧光强度降低现象。有机荧光色素光漂白速率很快，而量子点光漂白作用则小得多。含有“调色”功效，一元激发多元发射不一样粒径量子点含有不一样颜色，可用同一波长光激发不一样大小量子点，取得各种标识颜色。激发光波长宽，而发射光波长窄量子点激发光波长范围很宽，含有较大Stokes位移和狭窄对称荧光谱峰。抗体的标记医学知识专家讲座第36页量子点调色功效在紫外光激发下，相同组成不一样粒径量子点发射光谱抗体的标记医学知识专家讲座第37页量子点制备大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法。物理制备法可制得粒径易控量子点，但所需试验设备昂贵，广泛使用受限。化学合成法有水相和有机相合成法有机相体系

可制备性能优良量子点，如CdSe及CdSe/ZnS。

量子点分散性好、稳定性高、不易沉积，但水溶性太差。水相体系

操作简单、成本低廉、量子点表面形貌及性质可控、易修饰各种基团。抗体的标记医学知识专家讲座第38页量子点表面修饰无机壳层修饰法和化学修饰法是两种惯用量子点修饰方法。无机壳层修饰法合成核/壳结构量子点，如在CdSe量子点外面包覆一层CdS或ZnS就组成了以CdSe为核，以CdS或ZnS为壳量子点。化学修饰法用含巯基有机分子如二氢硫辛酸、巯基乙酸和聚乙二醇等对量子点进行表面修饰。抗体的标记医学知识专家讲座第39页六、胶体金胶体金（colloidalgold）也称金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外双离子层组成(内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷H+)。因为静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一个稳定胶体状态，形成带负电疏水胶溶液，故称胶体金。抗体的标记医学知识专家讲座第40页胶体金特征含有胶体各种特征尤其是对电解质敏感性，电解质能破坏胶体金颗粒外周水化层，从而打破胶体金稳定状态。胶体金颗粒大小不一样，呈色不一样，光吸收性也不一样最小胶体金(2nm～5nm)是橙黄色，中等大小胶体金(10nm～20nm)是酒红色，较大颗粒胶体金(30nm～80nm)则是紫红色。抗体的标记医学知识专家讲座第41页胶体金制备原理胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，聚合成一定大小金颗粒，形成带负电荷疏水胶溶液。惯用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。依据还原剂类型以及还原作用强弱，能够制备0.8nm～150nm不等胶体金颗粒。抗体的标记医学知识专家讲座第42页胶体金制备方法惯用方法为柠檬酸三钠还原法以制备16nm胶体金为例，取0.01%氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，磁力搅动下加入1%柠檬酸三钠水溶液2ml，淡黄色氯金酸溶液很快变灰色，继而黑色，随即成酒红色。金溶胶颗粒直径取决于制备时加入枸橼酸三钠量，保持其它条件不变，制备时加入不一样剂量柠檬酸三钠可取得不一样粒径胶体金颗粒。抗体的标记医学知识专家讲座第43页第二节惯用交联剂及特征抗体的标记医学知识专家讲座第44页重点提醒均一双功效交联剂非均一双功效交联剂交联剂方法抗体的标记医学知识专家讲座第45页交联剂生物大分子之间偶联，本质上是生物大分子中活性基团之间连接。其连接类型主要有：-NH2与-NH2

、-NH2与-CO2H、-SH与-SH、-NH2与-SH、糖基(-OH)与-NH2

、-C=O与-NH2

等。免疫标识惯用交联剂分子两端各有一个相同或者不一样活性基团，它们可与其它分子上氨基、巯基、羟基等基团发生共价结合而产生交联作用。抗体的标记医学知识专家讲座第46页交联剂类型依据其两个反应基团是否相同分为均一和非均一交联试剂。均一双功效交联剂，其两个反应基团相同。非均一双功效交联剂，两个反应基团不一样，每个基团可能于不一样条件下反应。大分子抗原、抗体标识是利用双功效交联剂使标识物与被标识物结构中游离氨基、羧基、硫氢基、咪唑基、酚基、羟基等基团形成不可逆连接。抗体的标记医学知识专家讲座第47页一、均一双功效交联剂

惯用均一双功效交联剂（homobifunctionalcross-linkingreagent）有戊二醛、碳二亚胺等。有-CHO、-N=C=O、-N=C=S、-SO2CH=CH2

等活泼双键,可与生物大分子中-NH2

、-OH、-SH等进行交联反应。原理简单，反应温和，适用范围广；

副反应较多,易发生多聚合和分子内交联，使交联物生物活性显著下降。抗体的标记医学知识专家讲座第48页碳二亚胺缩正当碳二亚胺能激活蛋白质分子上羧基，反应生成一个肽键（-CO-NH-），经碳二亚胺缩合反应，蛋白质分子中游离羧基与标识物分子中氨基形成较稳定酰胺键。抗体的标记医学知识专家讲座第49页戊二醛法戊二醛分子中两个醛基可分别与两个相同或不一样分子上伯氨形成Schiff碱,将两个生物大分子以五碳链桥连接起来。抗体的标记医学知识专家讲座第50页过碘酸钠氧化法利用过碘酸盐氧化糖蛋白中糖基邻二羟基成为醛基，再经过醛基与标识物分子中伯氨基反应形成schiff碱，后者经NaBH4还原—N＝C—键成为稳定结合物。抗体的标记医学知识专家讲座第51页N-羟基琥珀酰亚胺活化法

蛋白质分子羧基经过N-羟基琥珀亚酰胺活化，再与标识物分子中氨基偶联形成酰胺键。抗体的标记医学知识专家讲座第52页非均一双功效交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸醋(SPDP)等属于非均一双功效交联剂(heterobifunctionalcross-linkingreagent)。SPDP分子两端分别含有对脂肪链上巯基和伯氨基十分敏感，有专一作用二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基，可将含巯基和氨基两种蛋白质很轻易地交联起来；假如两种蛋白质不含巯基，可用SPDP在其中一个蛋白质分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巯基苏糖醇（DTT）还原成游离巯基，最终使二者交联起来。抗体的标记医学知识专家讲座第53页SPDP分子结构式抗体的标记医学知识专家讲座第54页SPDP交联原理将蛋白质（P1-NH2）经过酰胺化学反应，引入二硫吡啶基（DTP）。将DTP化蛋白质经过T-DE反应，与含巯基蛋白质（P2-SH）进行交联。假如第二种蛋白质分子（P2）不含巯基，可按反应（1）而得到P2-NH-DTP，再与二巯基苏糖醇（DTT）起反应，将DTP基还原成巯基，所得P2NHCOCH2CH2SH，再按反应（2）方式交联，制得结合物II（P1-NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2）。抗体的标记医学知识专家讲座第55页SPDP交联法优点对蛋白质伯胺基和脂肪族链上游离巯基反应敏感，专一性很强，反应轻易控制，可防止副反应。交联程度轻易测定，交联后大分子生物活性高于普通交联剂方法。可经过还原裂解使其再生。抗体的标记医学知识专家讲座第56页第三节放射性核素与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第57页重点提醒标识物与抗原抗体结合物制备基本方法标识物与抗原抗体结合物纯化标识物与抗原抗体结合物判定标识物与抗原抗体结合物保留抗体的标记医学知识专家讲座第58页放射性核素与抗原抗体结合物制备

一、基本方法氯胺T(ch-T)法是惯用标识方法，氯胺T是一个氧化剂，它能使125I+液中带负电荷碘离子氧化成带正电荷碘，然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上氢ch-T是对甲苯磺基酰胺N-氯衍生物钠盐，在水中易分解成具氧化性次氯酸：次氯酸可将125I﹣氧化成带正电荷125I+，后者可取代抗原（或抗体）中酪氨酸残基苯环上氢原子，形成稳定放射标识物；最终加入还原剂偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）可终止反应抗体的标记医学知识专家讲座第59页125I结合物制备直接标识法—氯胺T法化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，经过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上氢原子。

125I-Ch-T氧化125I或125I+取代反应125I-标识物（混合物）抗体的标记医学知识专家讲座第60页氯胺T(ch-T)法使用无还原剂高比放射性碘源ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1分钟～2分钟弱碱性反应条件抗体的标记医学知识专家讲座第61页二、放射性核素标识结合物纯化标识反应后形成结合物不能直接使用，需去除游离125I和其它杂质。游离125I和125I标识抗体（抗原）分子大小相差悬殊，采取凝胶层析即可分离，如葡聚糖凝胶（SephadexG-50）柱层析。抗体的标记医学知识专家讲座第62页125I结合物纯化凝胶过滤法离子交换层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱法

去除游离125I去除过分标识标识物抗体的标记医学知识专家讲座第63页三、放射性核素标识结合物判定放射性核素结合物判定包含放射化学纯度、比放射活性和免疫活性三个参数：放射化学纯度指在标识物中结合在抗原（或抗体）上放射活性占该标识物总放射活性百分比。比放射活性是指单位质量标识物中所含放射性强度，也可了解为每分子抗原（或抗体）平均所结合放射性原子数目，惯用Ci/g或Ci/mmol表示。免疫活性指标识物与抗原或抗体反应能力。免疫活性测定方法，用少许标识物与过量抗体反应，测定与抗体结合部分（B）放射活性，并计算与加入标识物总放射活性（T）百分比（B/T）。抗体的标记医学知识专家讲座第64页125I结合物判定

标识物质量高纯度高比放射活性完整免疫活性

放射化学纯度单位标识物中结合于抗原或抗体上放射活性占该标识物总放射性百分比应大于95%

免疫活性（immunoreactivity）标识物与抗原或抗体结合能力标识物与过量抗体反应百分比该值越大,标识物免疫活性好

抗体的标记医学知识专家讲座第65页四、放射性核素标识结合物保留

放射性核素标识结合物在2~8℃避光保留。注意放射防护，废弃物须按放射防护条例要求处理。标识物长久贮存后可因脱碘和本身辐射造成蛋白质破坏而形成碎片，一样能够采取上述方法对标识物重新进行纯化。抗体的标记医学知识专家讲座第66页第四节荧光素与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第67页一、基本方法荧光素与蛋白质结合化学反应基团主要有三种类型：酰基氯，由磺酸制备。异硫氰酸和重氮盐类，这两种通常由对应胺制备，经过化学键作用于对应抗原、抗体反应结合。当前标识方法主要是透析法和搅拌法两种：以FITC标识抗体（IgG）为例：FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG自由氨基结合，形成荧光抗体结合物。抗体的标记医学知识专家讲座第68页FITC标识结合物制备荧光素标识抗体方法原理:利用抗体蛋白自由氨基与FITC异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标识方法:搅拌法：适于标识体积较大、蛋白含量较高抗体。标识时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标识样品量少，蛋白含量低抗体。标识比较匀，非特异染色较低。抗体的标记医学知识专家讲座第69页透析法抗体的标记医学知识专家讲座第70页二、荧光素标识结合物纯化抗体标识完成后，还应对标识抗体进行纯化，以除去未结合游离荧光素，纯化方法可采取透析法和凝胶过滤法。透析法将标识抗体放入透析袋中，不停更换透析液透析1周左右，直至透析液在紫外灯照射下不发出荧光为止，本法适合用于蛋白含量低标识物。

凝胶过滤法将标识抗体经过SephadexG25或G50凝胶柱，洗脱第一峰为荧光素标识抗体峰，第二峰为游离荧光素峰，搜集第一峰即可。本法简便快捷，可在数小时内完成。抗体的标记医学知识专家讲座第71页三、荧光素标识结合物纯化荧光抗体纯化去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过分抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收抗体的标记医学知识专家讲座第72页荧光素标识结合物判定荧光抗体判定荧光素与蛋白结合率

F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验保留：-20℃：保留1年～2年真空干燥：长久保留抗体的标记医学知识专家讲座第73页第五节酶与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第74页普通是经过交联剂将酶与抗体或抗原相结合。交联方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法等。普通都是利用小分子上活性部位与蛋白质上氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。抗体的标记医学知识专家讲座第75页一、基本方法制备方法过碘酸钠法（直接法）惯用于HRP标识抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标识效率比一步法高，酶标识物质量较均一。过量戊二醛+酶酶-戊二醛-抗体（抗原）洗涤Ab/Ag抗体的标记医学知识专家讲座第76页戊二醛交联法戊二醛为同源双功效交联剂，它有两个相同醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上氨基结合。戊二醛法又依据试剂加入方法分为一步法和二步法。一步法是将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时发生反应。此法操作简便，可用于HRP、ALP标识抗体(抗原)。但酶标识物产率低，酶标识物易聚合，而且酶与酶、抗体与抗体之间也会发生交联，影响标识物质量。抗体的标记医学知识专家讲座第77页戊二醛交联法二步法则是将相对过量戊二醛与酶反应，让酶分子上氨基仅与戊二醛上醛基结合，不发生酶与酶之间结合，除去未与酶结合多出戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶-戊二醛-抗体(抗原)结合物。其特点是酶标识物均一，标识效率也较一步法提升。抗体的标记医学知识专家讲座第78页改良过碘酸钠法此法是当前用于HRP标识抗体或抗原最惯用方法。过碘酸钠可将与酶活性无关多糖羟基氧化为醛基，后者与抗体蛋白中游离氨基结合形成Schiff碱，再加入硼氢化钠还原后，即生成稳定酶标识物。为预防酶蛋白分子中氨基与醛基发生本身偶联反应，标识前需用2,4-二硝基氟苯封闭酶蛋白分子中残余α-氨基和ε-氨基。抗体的标记医学知识专家讲座第79页二、酶标识结合物纯化标识完成后应除去反应液中游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，防止游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度。惯用纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯抗体的标记医学知识专家讲座第80页三、酶标识结合物判定每批制备酶标识物都要进行质量和标识率判定，质量判定包含酶活性和抗体（抗原）免疫活性判定。惯用判定方法：免疫电泳或双相扩散法惯用免疫电泳或双向扩散法，出现沉淀线表示酶标识物中抗体（抗原）含有免疫活性。沉淀线经生理盐水重复漂洗后，滴加底物溶液，若能在沉淀线上显色，则表示酶标识物中酶仍含有活性。也可直接用ELSIA方法测定酶标识率测定惯用分光光度计法分别测定酶标识物中酶和抗体（抗原）蛋白含量，再用公式计算其标识率。抗体的标记医学知识专家讲座第81页四、酶标识结合物保留

酶标抗体中酶和抗体均为生物活性物质，保留不妥，极易失活。高浓度结合物较为稳定，冷冻干燥后可在普通冰箱中保留一年左右，但冻干过程中引发活力减低，而且使用时需经复融。结合物溶液中加入等体积甘油可在低温冰箱或普通冰箱冰格中较长时间保留。抗体的标记医学知识专家讲座第82页第六节化学发光剂与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第83页一、基本方法化学发光剂标识反应分为直接偶联和间接偶联两种方式：直接偶联是经过偶联反应，使标识物分子中发光集团直接连接到被标识物分子反应基团上。间接偶联是经过交联剂在标识物和被标识物之间插入一条链或一个基团，经过“桥”能够在原有结构中引进新活性基团，增加反应活性，减弱偶联双方分子结构中存在空间妨碍效应。抗体的标记医学知识专家讲座第84页二、化学发光剂标识结合物纯化

多数经偶联反应制备结合物，使用前需采取透析法、凝胶过滤法或盐析沉淀法等进行纯化，目标是除去反应系统中存在未结合发光剂和交联剂。抗体的标记医学知识专家讲座第85页三、化学发光剂标识结合物判定因为标识过程不规范或存放过程中可能出现脱落现象，对新制备已纯化或经长时间保留结合物，在使用前均需测定蛋白质含量、免疫学活性和发光效率等三项指标，以确保试验结果准确、可靠。抗体的标记医学知识专家讲座第86页四、化学发光剂标识结合物保留

结合物普通可分装保留在-70~4℃条件下，最好冷冻干燥保留，这么可保留多年之久不丧失活性。抗体的标记医学知识专家讲座第87页第七节稀土离子与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第88页一、基本方法镧系元素离子不能直接与抗原或抗体分子结合，需利用含有双功效基团螯合剂。惯用双功效螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-EDTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等。螯合剂可先螯合EU3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合EU3+(二步法)。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子载体蛋白（牛血清白蛋白、多聚赖氨酸等）连接，再标识EU3+。抗体的标记医学知识专家讲座第89页第八节量子点与抗原抗体结合物制备抗体的标记医学知识专家讲座第90页一、基本方法量子点与抗原、抗体等生物分子偶联方法主要有静电吸附法、生物素-亲和素法及共价结正