TCALAS 88-2020 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法

ICS65.020.30B44中国实验动物学会团体标准T/CALAS88—2020实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法Laboratoryanimal-MethodfordetectionofBordetellapseudohinzii2020-12-01发布 2021-01-01 实施中国实验动物学会 发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：广东省实验动物监测所。本文件主要起草人：黄树武、陈梅玲、罗银珠、何丽芳、闵凡贵、王静、张钰。鏈鏈鏈鏈实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法范围本文件规定了实验动物伪欣氏鲍特菌（Bordetellapseudohinzii）病原分离培养鉴定。本文件适用于啮齿类实验动物中伪欣氏鲍特菌的检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.42 《实验动物 细菌学检测 标本采集》GB/T14926.43 《实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂》GB19489 《实验室生物安全通用要求》基本原理伪欣氏鲍特菌为革兰氏阴性杆菌，在血琼脂平皿上培养可形成特殊的菌落形态，有独特的生化反应，据此可进行该菌的分离培养和检测。主要设备和材料a）b）生物显微镜。培养基和试剂a）血琼脂平皿。b）DHLc）d）过氧化氢酶。e）革兰氏染色液。f）生化试验试剂：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、松二糖、松三糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、阿拉伯醇、侧金盏花醇、三糖铁、半固体、丙二酸盐、西蒙氏柠檬酸盐、硝酸盐、尿素酶、明胶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶。实验动物伪欣氏鲍特菌检测方法实验动物伪欣氏鲍特菌检测方法105检测程序操作步骤生物安全措施实验操作及处理按照GB19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。采样无菌操作采取动物的呼吸道分泌物。分离培养DHL（36±1）24h～48h。鉴定挑选血琼脂平皿或DHL琼脂平皿上可疑菌落，染色镜检，镜检符合菌体特征的接种血琼脂平皿纯培养，置（36±1）℃培养24h。从血琼脂平皿上挑取新鲜菌落做生化反应试验。菌落特征1mm～2mm光滑、半透明、湿润的菌落，表现为黏液的表型，本观察到溶血现象。DHL琼脂平皿上2mm左右的菌落。菌体特征革兰氏染色阴性，微小的杆菌（短杆菌），大小（0.2～0.5）μm×（0.5～2.0）μm，106106第三篇实验动物检测方法系列标准两极浓染，单个或成对排列。鞭毛染色观察到细菌纤细的杆状，有丰富的周围鞭毛，无荚膜，无芽孢。氧化酶试验氧化酶试验阳性。过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验阳性。生化鉴定不发酵糖醇类：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、松二糖、松三糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、阿拉伯醇、侧金盏花醇。三糖铁反应为碱-碱反应，不产硫化氢气体。半固体动力试验阳性，丙二酸盐阳性，西蒙氏柠檬酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，明胶液化试验阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性。与1。表1支气管鲍特杆菌与伪欣氏鲍特菌比较项目 支气管鲍特杆菌 伪欣氏鲍特菌DHL氧化酶三糖铁++K/K，不产硫化氢++K/K，不产硫化氢动力++尿素酶+–硝酸盐还原+/––西蒙氏柠檬酸盐利用++丙二酸盐试验–+结果判定经鉴定符合7.4中各项检测结果的，可判定为伪欣氏鲍特菌。结果报告凡符合上述各项检测结果者作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。参考文献BengaL,BentenWPM,EngelhardtE,etal.2014.16SribosomalDNAsequence-basedidentificationofbacteriainlaboratoryrodents:apracticalapproachinlaboratoryanimalbacteriologydiagnostics.LabAnim,48:305-312.HayashimotoN,MoritaH,YasudaM,etal.2012.PrevalenceofBordetellahinziiinmiceinexperimentalfacilitiesinJapan.ResVetSci,93:624-626.实验动物伪欣氏鲍特菌检测方法实验动物伪欣氏鲍特菌检测方法107HayashimotoN,YasudaM,GotokK,etal.2008.StudyofaBordetellahinziiisolatefromalaboratorymouse.ComparativeMedicine,58(5):440-446.IvanovYV,ShariatN,RegisterKB,etal.2015.AnewlydiscoveredBordetellaspeciescarriesatranscriptionallyactiveCRISPR-CaswithasmallCas9endonuclease.BMCGenomics,16:863.LoongSK,MahfodzNH,MohamadWali,etal.2016.Molecularandantimicrobialanalysesofnon-classicalBordetellaisolatedfromalaboratorymouse.JVetMedSci,78:715-717.LoongSK,TanKK.,Sulaiman,S.,etal.2017.DraftgenomeofBordetellapseudohinziiBH370isolatedfromtracheaandlungtissuesofalaboratorymouse.GenomData,12:69-70.PernissA,SchmidtN,GurtnerC,etal.2018.Bordetellapseudohinziitargetsciliaandimpairstrachealcilia-driventransportinnaturallyacquiredinfectioninmice.ScientificReports,8:5681.SpilkerT,LeberAL,Mar